jwillis0720

Гена устойчивости к неомицину в клетках stb3 E.coli


Молекулярная биология Клонирование Биология

Мы используем вектор упаковки лентивирусов, называемый pLenti_puro_DEST . Мы используем пуромицин для выбора клонированного гена в клетках 293T. Однако pLenti_Neo_Dest был прекращен, поэтому я клонирую ген устойчивости к неомицину в pLenti_Puro_Dest, заменив таким образом Puromycin Neomycin. Я обычно выращиваю этот ген в клетках Stb3 или Stb4 от invitrogen. Мне интересно, могу ли я выбрать для клонированных векторов pDEST в этих ячейках, используя Neomycin или G418. Согласно руководству G418, теоретически вы можете использовать его для выбора бактерий, но я думаю, что это может быть для библиотек, а не для взросления плазмиды.

Так можно ли выбрать для моей плазмиды в этих клетках, добавив немного пластины G418 к пластинке ампициллина? Это распространено? Я не могу найти никого, кто выбирает бактерии Неомицином где угодно.

EDIT. Основная причина, по которой я спрашиваю, заключается в том, что ген устойчивости находится под промоутером PGK, который я понятия не имею, работает ли он в бактериальных клетках.

243
Промоторы млекопитающих в основном не действуют на бактерии.

Ответы


WYSIWYG

PGK является промотором фосфаглицераткиназы млекопитающего (мышиного). Поэтому он не будет работать в бактериальных системах. Почему бы вам не выбрать только ампициллин? Вы можете увеличить концентрацию ампициллина, если хотите.

Что касается:

Я не могу найти никого, кто выбирает бактерии Неомицином где угодно.

Канамицин обычно используется для отбора бактерий. Ген устойчивости к неомицину работает на неомицине, канамицине и G418 (вариант гентамицина). Ген в основном кодирует аминогликозид-фосфотрансферазу, а различные варианты гена имеют различную аффинность для различных аминогликозидных субстратов. Для получения базовой справки см. Это .

jwillis0720
Я выбираю ампициллин, но любой остаточный родительский вектор (от клонирования) также будет содержать ампициллин.

WYSIWYG♦
@ jwillis0720 Для этого вам нужно сделать скрининг. Вы можете сделать скрининг колонии-ПЦР, который относительно быстрее, чем другие методы. Также у вас есть контроль лигирования, чтобы иметь представление о том, сколько колоний вам нужно для экрана. Это клейкий конец клонирования?

243
Плазмидная конструкция - это метод получения плазмид, несущих ваши вставки из пустых векторов, несущих одинаковые устойчивые маркеры. Если вы хотите выбрать канамицин / неомицин, вы можете взять бактериальную экспрессирующую единицу гена канамицин / неомицин. Фактически, существуют плазмиды, которые несут канамицин с промоторами бактерий и млекопитающих,

jwillis0720
Я просто провежу PCR. Но это сборка гибсона.

WYSIWYG♦
@ jwillis0720 не проблема. Просто используйте концевые праймеры и экран для ампликона соответствующего размера.

alec_djinn

В этой статье (Li and Elledge, Nature Genetics, 2005) показано, что промотор PGK работает в E.coli, но он имеет очень мало активности. Таким образом, я не думаю, что он подходит для правильного выражения резистентного фермента.

О Неомицине многие ферменты, резистентные к аминогликозидам (не все), которые работают на Канамицине, хорошо работают и с неомицином. Я лично выбрал E.coli, выражающий сопротивление Кан (из вектора ПЭТ), используя Неомицин без проблем.

Смотри также