Какова роль tracrRNA в CRISPR-cas9?

Два ваших вопроса связаны, и вы правы в своем предположении, что белок Cas9 связан с определенной последовательностью РНК. Тот из tracrRNA, который преобразуется с crRNA в gRNA. Это достигается без какой-либо другой помощи, поэтому можно считать, что это делается автоматически. Насколько специфичной должна быть последовательность tracrRNA - интересный и часто упускаемый из виду вопрос.

При сравнении tracrRNA разных видов становится ясно, что консервативность последовательности незначительна, но предполагается, что они будут содержать сходные вторичные структуры.

Совпадение tracrRNA и Cas9 у близкородственных видов действительно приводит к расщеплению ДНК in vitro , но это не работает с более отдаленно родственными видами. Тем не менее, они удивительно универсальны, и это было использовано в ряде захватывающих приложений геномной инженерии, где дополнительные структуры добавляются без ущерба для связывания РНК с Cas9.

tracrRNA и crRNA вместе образуют гРНК, которая направляет белок Cas9 к месту расщепления. В эндогенных бактериальных системах гРНК принимает форму процессированного дуплекса РНК, но в реализациях редактирования генома она принимает форму одиночной химерной РНК с двумя уже слитыми вместе компонентами.

Когда дело доходит до фактического расщепления ДНК, важно, чтобы Cas9 имел правильную конформацию, и известно, что изменения в ней происходят при связывании с ДНК-мишенью. Недавняя работа предполагает, что tracrRNA играет роль в поддержании белка Cas9 в активной форме, что позволяет ему нацеливаться на ДНК.

Вероятно, это также способствует общей стабильности (и, следовательно, эффективности) комплекса CRISPR-Cas9.

В конечном счете, tracrRNA является важным компонентом системы CRISPR-Cas9 благодаря своей роли как в направлении белка Cas9 к его цели, так и в содействии его функции.

Вам могут быть интересны следующие ссылки:

Семейства tracrRNA и Cas9 систем иммунитета CRISPR-Cas типа II

Руководство по разработке РНК для универсальной функциональности Cas9

Структурная роль направляющих РНК в нуклеазной активности эндонуклеазы Cas9

Короче говоря, tracrRNA сохраняет каталитическую активность комплекса CRISPR-Cas9 (из РНК и белка Cas9):

^{Источник изображения: рисунок 5 из Lim, Y. et al., 2016. Структурные роли направляющих РНК в нуклеазной активности эндонуклеазы Cas9. Nature Communications, 7, стр. 13350. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1038/ncomms13350 .}

Это было показано путем предварительной инкубации различных наборов компонентов вместе в течение 20 минут с последующим добавлением отсутствующих компонентов и наблюдением за результирующей активностью расщепления ДНК. Например, в «розовом» эксперименте только белок Cas9 и tracrРНК предварительно инкубируют вместе, а crРНК добавляют непосредственно перед 5-минутным временем расщепления:

^{Источник изображения: рисунок 1 из Lim, Y. et al., 2016. Структурные роли направляющих РНК в нуклеазной активности эндонуклеазы Cas9. Nature Communications, 7, стр. 13350. Доступно по адресу: http://dx.doi.org/10.1038/ncomms13350 .}

Зеленая полоса представляет собой белок Cas9, предварительно инкубированный в течение 20 минут как с tracrRNA, так и с crRNA. Розовая полоса показывает, что предварительная инкубация с tracrRNA, но без crRNA, по-прежнему приводит к тому же уровню активности (измеряется как доля продукта расщепления). Однако, когда tracrRNA не включается в предварительную инкубацию, как в экспериментах с желтым и синим цветом, активность значительно снижается.