Как я могу сохранить клетки HEK живыми, экспрессируя рецепторы NMDA?

рация

Как я могу сохранить клетки HEK живыми, экспрессируя рецепторы NMDA?

Я пытаюсь экспрессировать функциональные рецепторы NMDA в клетках линии HEK293 для экспериментов по одноканальной записи.

Клетки HEK поддерживают стандартным способом ( Thomas & Smart 2005 ) и трансфицируют кДНК субъединиц NR1 и NR2x, а также GFP, используя либо липофектамин, либо преципитацию фосфатом кальция. Экспрессия GFP предполагает успешную трансфекцию, но клетки, демонстрирующие зеленую флуоресценцию, равномерно набухшие и мертвые, и более или менее невозможно получить успешный пластырь. Нетрансфицированные клетки остаются вполне жизнеспособными.

Основываясь на том, что токсичность может быть следствием притока Ca 2+ через открытые NMDAR, я попытался включить в среду для выращивания коктейль блокаторов, включая AP5, кинуреновую кислоту и Mg 2+ , но трансфицированные клетки продолжают умирать. .

Может ли кто-нибудь предложить что-нибудь еще, что я должен делать, чтобы сохранить клетки живыми? Или я просто ничего не скрываю? Другие исследователи, похоже, справились с этим (например , Медина и др., 1995 , Вичини и др., 1998 ) и, кажется, не делают ничего существенно другого, так что я немного в растерянности.

пользователь22143

Вам необходимо заблокировать NMDAR с помощью 200 мкМ AP5 или 1 мМ кинуреновой кислоты. Мы также использовали 10 мМ MgCl2.

Алеадам

Попробуйте, возможно, снизить уровень экспрессии вашей конструкции. Клетки HEK печально известны тем, что экспрессируют большое количество вашей трансфицированной вставки. Он у вас под промоутером CMV? Попробуйте более мягкую систему, такую ​​как промотор убиквитина или аналогичную или, что еще лучше, систему, индуцируемую доксициклином (например, tet off компании clontech ), чтобы вы могли управлять уровнями экспрессии посредством концентрации dox/времени индукции.

рация

Он действительно использует промоутер CMV, так что на это стоит обратить внимание. Одно предложение, которое я видел, состоит в котрансфекции с высоким коэффициентом «пустой» плазмиды pcDNA в качестве конкурента для снижения экспрессии. Это немного похоже на Хита Робинсона, но это будет более простой тест, чем сплайсинг в новый вектор...

Алеадам

Конечно, вы можете попробовать. Я ожидаю, что это снизит эффективность трансфекции, а не уровень экспрессии на клетку, но это достаточно просто, чтобы попробовать это прямо сейчас. Удачи! Кстати: мне пришлось погуглить «Хит Робинсон»: неплохо!