Как я могу сохранить клетки HEK живыми, экспрессируя рецепторы NMDA?
Я пытаюсь экспрессировать функциональные рецепторы NMDA в клетках линии HEK293 для экспериментов по одноканальной записи.
Клетки HEK поддерживают стандартным способом ( Thomas & Smart 2005 ) и трансфицируют кДНК субъединиц NR1 и NR2x, а также GFP, используя либо липофектамин, либо преципитацию фосфатом кальция. Экспрессия GFP предполагает успешную трансфекцию, но клетки, демонстрирующие зеленую флуоресценцию, равномерно набухшие и мертвые, и более или менее невозможно получить успешный пластырь. Нетрансфицированные клетки остаются вполне жизнеспособными.
Основываясь на том, что токсичность может быть следствием притока Ca 2+ через открытые NMDAR, я попытался включить в среду для выращивания коктейль блокаторов, включая AP5, кинуреновую кислоту и Mg 2+ , но трансфицированные клетки продолжают умирать. .
Может ли кто-нибудь предложить что-нибудь еще, что я должен делать, чтобы сохранить клетки живыми? Или я просто ничего не скрываю? Другие исследователи, похоже, справились с этим (например , Медина и др., 1995 , Вичини и др., 1998 ) и, кажется, не делают ничего существенно другого, так что я немного в растерянности.
Попробуйте, возможно, снизить уровень экспрессии вашей конструкции. Клетки HEK печально известны тем, что экспрессируют большое количество вашей трансфицированной вставки. Он у вас под промоутером CMV? Попробуйте более мягкую систему, такую как промотор убиквитина или аналогичную или, что еще лучше, систему, индуцируемую доксициклином (например, tet off компании clontech ), чтобы вы могли управлять уровнями экспрессии посредством концентрации dox/времени индукции.
пользователь22143