Я читаю документы ENCODE, что выводит меня из зоны комфорта с точки зрения современных лабораторных методов. Рискуя задать вопрос, на который вполне можно подробно ответить где-нибудь еще в Интернете, я надеялся получить краткое объяснение трансфекции ядер.
В Whiteld et all они описывают прямой анализ эффективности сайта связывания фактора транскрипции в клетках человека. Для этого они трансфицировали плазмиду люциферазы, предположительно, в ядро клетки (поскольку впоследствии они наблюдают, что плазмида люциферазы транскрибируется).
Прочитав «Материалы и методы» и дойдя до дополнительного файла, они раскрыли свой протокол трансфекции. Соответствующие реагенты выглядят следующим образом:
ФуГене 6
нелипосомный препарат, предназначенный для трансфекции плазмидной ДНК в широкий спектр клеточных линий с высокой эффективностью и низкой токсичностью.
(С веб-сайта Promega.)
Липофектамин LTX
эффективный реагент для доставки плазмиды и экспрессии белка
(С веб-сайта Invitrogen.)
ПЛЮС реагент
PLUS™ Reagent используется в сочетании с реагентами для трансфекции, такими как Lipofectamine™, для усиления трансфекции в прикрепленных клеточных линиях.
(С веб-сайта Invitrogen.)
По-видимому, протокол заключается в том, чтобы соединить плазмиду ДНК с реагентом для трансфекции, подождать несколько минут, затем добавить клетки и инкубировать при 37ºC в течение 24 часов. Это все, что требуется для попадания плазмиды в ядро.
Я проконсультировался с Википедией и 4-м изданием Страчана и молекулярной генетики человека Рида, но не смог ответить на свой вопрос об этой технике.
Я думаю, что у меня есть довольно четкое представление о том, как эти реагенты могут проходить через липидную мембрану клетки, но у меня нет аналогичного понимания того , как ДНК затем переходит в ядро .
В 4-м издании Human Molecular Genetics я могу найти только один абзац о переносе плазмиды через ядерную мембрану, стр. 704: «Транспорт плазмидной ДНК в ядро неделящихся клеток очень неэффективен, потому что плазмидная ДНК часто не может проникнуть в поры ядерной мембраны. Для облегчения проникновения в ядро можно использовать различные методы, такие как конъюгирование определенных последовательностей ДНК или белковых последовательностей (последовательности ядерной локализации), которые, как известно, облегчают проникновение в ядро, или уплотнение ДНК до размера, достаточного для прохождения через ядерные поры».
Но ничего в разделе материалов и методов Whiteld et. все упоминает любой из этих методов. Я уверен, что они упомянули бы, если бы их плазмида включала последовательность конъюгации ДНК, так что этого не может быть. Возможно, эти реагенты неявно включают в себя какой-то поликатион компактизации ДНК, такой как PEG-CK30?
Не является ли цитоплазма чрезвычайно враждебным местом для ДНК-плазмид? Разве они не должны просто вертеться в цитоплазме, пока не переварятся?
Или, возможно, эти векторы проникают в ядро во время митоза? (Это теория, которая только что пришла мне в голову, когда я обдумывал «неразделяющую» квалификацию в цитате Страчана.)
Поскольку этот вопрос не рассматривается в статье, я могу только предположить, что ответ элементарный и что-то, что должен знать профессиональный клеточный биолог. У меня закончились очевидные следующие шаги для поиска ответа, поэтому заранее прошу прощения за вопрос.
Моя попытка найти ответ показала, что никто не знает, как ДНК попадает в ядро.
В этой относительно недавней статье сообщается о попытках отследить путь проникновения ДНК и ее переноса в ядро.
Ле Бихан и др . (2010)Исследование in vitro механизма действия липоплексов катионных липидов/ДНК в нанометрическом масштабе. Нукл. Кислоты рез. 39 :1595-1609
В качестве метода использовалась просвечивающая электронная микроскопия. Комплексы плазмидной ДНК + катионные липиды (липоплексы) метили наночастицами на основе кремнезема для обеспечения визуализации.
Авторы описывают путь трансфекции с пятью этапами:
(i) связывание липоплексов с клеточной поверхностью;
(ii) проникновение липоплексов в клетки преимущественно путем эндоцитоза (нельзя исключить прямое слияние с клеточной мембраной);
(iii) выход ДНК в цитозоль;
(iv) транспорт через цитозоль; и
(v) проникновение ДНК в ядро и ядерную транскрипцию.
Авторы смогли выполнить каждый из первых четырех шагов, но:
наши данные показывают, что наночастицы находятся близко к ядру, но не внутри него.
Они предполагают, что это может означать, но не ссылаются ни на какие ранее опубликованные данные. Мой вывод таков, что ответ на ваш вопрос, как я сказал в начале своего ответа: никто не знает, как трансфицированная ДНК попадает в ядро.
Zabner et al . (J. Biol. Chem., 1995, 270 , 18997-19007) наблюдали за образованием и поглощением комплекса липид-ДНК, которое, как было обнаружено, происходит преимущественно за счет эндоцитоза. Эксперимент с дот-блоттингом показывает, что клетки (50% популяции) заняли 60% ДНК. Было обнаружено, что ДНК-белковый комплекс откладывается в перинуклеарной цитоплазме и образует ряд регулярно упакованных канальцев. Они также подтвердили, что эндосомы, несущие комплекс, не сливались с лизосомами.
Часть ДНК ускользает от эндосомы (что является известным механизмом повышения эффективности трансфекций, основанных на эндоцитозе) и может быть поглощена ядром. Когда они сравнивали экспрессию репортерного гена при прямой инъекции в ядро и при прямой инъекции в цитоплазму, в последней экспрессии не наблюдалось (по Capecchi (Cell, 1980) соотношение экспрессии составляет около 1000:1. PDF доступно на веб-сайте Университета штата Юта). Это означает, что поглощение ДНК ядром из цитоплазмы очень неэффективно.
Меньшее количество липидов в комплексе белок-ДНК повышает эффективность.
На ваш вопрос частично дан ответ. Как вся ДНК, которую поглощает клетка, попадает внутрь ядра? В основном это не так. Он накапливается вокруг ядра. Но часть свободной ДНК поглощается ядром. Это, наверное, и стало отправной точкой для группы Дина.
Vaughan и Dean (Mol.Ther., 2006, 13(2) 422-428) предположили, что плазмиды транспортируются в ядро с помощью связанного с микротрубочками двигательного белка Dynein. Они заметили, что нарушение функциональности сети микротрубочек ингибирует экспрессию. Когда плазмиды вводили непосредственно в ядра клеток, это не давало эффекта. Теперь микротрубочки транспортируют вещества с помощью моторных белков, из которых Dynein транспортирует вещества к ядру. Было замечено, что ингибирование действия динеина снижает экспрессию. Механизм связывания динеина с плазмидой неизвестен. (Я работал с динеином; это сложно, когда дело доходит до механизмов связывания. Весь отрицательно заряженный N-конец неупорядочен.)
Если вы прочитаете обсуждение статьи, станет очевидно, что процесс хаотичен. Чем больше дисперсия ДНК в цитоплазме вокруг ядра, тем больше ее поглощение ядром.
Здесь нет сигнала ядерной локализации. Mesika et al (Human Gene Ther., 2005) повысили эффективность экспрессии плазмид путем связывания плазмид с белком с помощью NLS. Это не естественный процесс. Vaughan и Dean предположили, что целевая последовательность ДНК ( например , SV40, CMV и т. д.) связывается с белками, которые имеют NLS или имеют адаптеры для связывания динеина (например, факторы транскрипции), которые могут способствовать поглощению плазмиды ядром. Это также может объяснить дифференциальное поглощение плазмид на основе последовательностей. Ни один из этих механизмов не был экспериментально подтвержден.
[Я тоже задавался этим вопросом. Я прослушивал многих пожилых людей и рыскал в сети в поисках ответов. И тут я нашел этот вопрос. Спасибо за вопрос]
Это вопрос, который время от времени возникает, когда доктора наук или доктора наук обсуждают трансфекцию. Вероятный ответ, для которого у меня нет подтверждающей литературы, таков: если у вас есть трансфекционный комплекс в среде во время деления клеток, возможно, что они могут проникнуть в ядро после митоза, когда ядерная мембрана все еще формируется, таким образом давая это доступ к механизму транскрипции в ядре.
каменщик
пользователь137