Насколько вреден бромистый этидий в вашей плазмиде для последующих приложений?

Я хочу трансфицировать стволовые клетки, полученные из жировой ткани, используя собственный клон. Моя проблема в том, что я получаю много загрязнений (не только геномных, но и из-за характера техники я получаю нежелательные продукты, от которых не могу избавиться).

Поэтому я подумал о том, чтобы запустить гель с моими образцами плазмидной ДНК и очистить гель от нужных мне полос. Однако я не знаю, будет ли загрязнение моего образца бромистым этидием проблемой или обычный набор для извлечения из геля поможет избавиться от него.

Нет, с этим абсолютно нет проблем. И вы все равно избавляетесь от EtBr при очистке.
Токсичность этидия, вероятно, не так серьезна, как вам кажется, они используют его в дозе 1 мг/кг для крупного рогатого скота для предотвращения паразитарных инфекций.
И я должен отметить, что использовать плазмиду, очищенную от геля, непосредственно в трансфекции клеток млекопитающих неэффективно. Вам следует подумать о более масштабной подготовке. Если проблема заключается в неправильных плазмидах, трансформируйте смесь плазмид в бактерии, выберите несколько ОДИНОЧНЫХ колоний и подготовьте их, секвенируйте и повторите попытку.
Возможный дубликат biology.stackexchange.com/questions/14047/…
Спасибо за ваши содержательные ответы! Чтобы ответить пользователю 137: я не могу расширить свою плазмиду в бактериях, чтобы использовать более крупный препарат, поскольку последовательность OriR вырезается и деградирует из конструкции после индукции арабинозой. Вот что я пытаюсь получить: ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4144359 Еще раз спасибо
@Varekai Я использовал миникруги раньше, это больно, но вам, вероятно, придется вернуться к этапу бактерий и вырастить родительскую плазмиду миникруга в большом объеме и пройти этап рекомбинации, чтобы удалить бактериальные элементы, затем гигапреп плазмида. Если вы не получаете 100% конверсию родительской плазмиды в миникольцо, обратитесь к разделу устранения неполадок вашего руководства и повторите процедуру.

Ответы (1)

Очистка и выделение полос ДНК путем их вырезания из агарозного геля является обычным явлением (Lee et al ., 2012) . Этап очистки после удаления полосы позволяет избавиться от большей части EtBr и других примесей. Например, см. веб-сайты Isogen и Sigma-Aldrich .

Ссылка
- Lee et al. J Vis Exp (2012); 62 : e3923

Насколько вреден бромистый этидий в вашей плазмиде для последующих приложений?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v