Мне любопытно, какой ущерб потенциально может нанести напряжение сдвига при пипетировании. Я знаю, что шприцы, используемые для инъекций стволовых клеток, могут причинить много вреда. Однако в какой степени это происходит с наконечниками для пипеток P20 и P200? Понятно, что модуль сдвига бактериальных клеток значительно отличается от модуля сдвига раковых клеток, который будет отличаться от модуля сдвига стволовых клеток.
Это отличный вопрос, я обучаю людей культивированию клеток около 12 лет, и студентам трудно понять это и оценить важность и т. д.
То, что клетки обычно испытывают во время пипетирования, аналогично толпе людей, пытающихся пройти через дверной проем здания. Сдвиг во время пипетирования, безусловно, является законной проблемой в культуре клеток. Вы заметите его отрицательное влияние на жизнеспособность наиболее явно при пипетировании клеток в замораживающей среде (содержащей ДМСО) после оттаивания. Пока их концентрация ДМСО не падает, их мембраны слабее и более жидкие. Вот почему вы пипетируете замороженные клетки по каплям в свежую среду, чтобы быть особенно осторожным на этом этапе.
Прокариотические клетки, такие как упомянутые выше клетки TOP10, обрабатывают хлоридом кальция и глицерином, который оказывает по существу такое же действие на их стенки и мембраны. Следовательно, пипетирование должно быть деликатно выполнено после оттаивания этих клеток.
При этом, если вы сравните чувствительность прокариотических и эукариотических клеток к сдвигу, эукариотические клетки гораздо более чувствительны.
Для людей, использующих компетентные бактерии для субклонирования и других рутинных целей, уничтожение небольшого процента ваших клеток не так важно. Однако, если вы используете преобразование для создания библиотек кДНК, очень важно, чтобы у вас был титр, достаточно отражающий транскриптом, из которого состоит библиотека.
В этих случаях важно использовать компетентную ячейку премиум-класса, соблюдать правильную температуру и минимизировать пипетирование. Вот почему многих учат смешивать ДНК с компетентными клетками, а не более жесткой альтернативой: пипетированием вверх-вниз.
Четыре наиболее важных фактора, влияющих на клеточный сдвиг, в порядке от большей к меньшей:
Потому что состав самой клетки так сильно влияет на количество повреждений, а также из-за огромного разнообразия клеток; разработка репрезентативного эксперимента для оценки ущерба была бы очень сложной и трудоемкой.
Наконец, разнообразие наконечников и сериологических препаратов также огромно. Однако, если бы кто-то попытался оценить это, это можно было бы сделать:
Выберите репрезентативное разнообразие клеточных линий, выберите репрезентативное разнообразие пипеток. Вероятно, было бы желательно использовать роботизированную пипетку, чтобы иметь возможность оценивать постепенно назначаемые скорости и давления. Посмотрите на разные концентрации культур, фазы кривой роста, время между пипетированием и анализом, расстояние между выходящей жидкостью и культурой и т.д. и т.п.
Я думаю, что очень успешным методом анализа было бы использование йодида пропидия и FACS.
После вашего эксперимента, который будет стоить много времени и денег, я думаю, вы найдете правила здравого смысла: сведите пипетирование к минимуму и по возможности используйте более широкие наконечники.
Это простой эксперимент. Возьмите аликвоту клеток в 10 микроцентрифужных пробирок и пипетируйте каждую суспензию увеличивающееся количество раз, окрашивайте трипановым синим и подсчитывайте.
Наиболее важным фактором будет то, какой тип пипетки вы используете; Я ожидаю, что p1000 вызовет больше повреждений, чем p200, а затем p20 из-за скорости жидкости. Также наиболее важным фактором будет мастерство ученого, если вы пипетируете медленно, это должно снизить стресс, в отличие от быстрого пипетирования.
По моему опыту, это зависит от типа пипетки и навыков оператора. Единственный способ ответить на этот вопрос для вас — это попробовать эмпирически.
Как ни странно, я не наблюдал какой-либо гибели клеток при пипетировании E. coli DH5alpha или TOP10, однако для компетентных клеток смешивание путем пипетирования вверх и вниз не рекомендуется из-за скомпрометированной клеточной стенки.
Этот вопрос лучше задать в физике или химии. Я не думаю, что у нас есть общая инженерия, где гидродинамику можно было бы описать другим методом, чем физика, но если бы мы это сделали, на это также должен был бы быть дан ответ.
Действительно, осмотическое или жидкостное давление само по себе вызывает изменения, возможно, повреждения клетки. Затем другие экзотермические и эндотермические реакции на химические вещества из-за силы удара, такие как ожог химией или трением.
Я уверен, что другие требования сохранения энергии я полу-опасно проигнорировал.
Я нашел эту интересную статью, в которой основное внимание уделяется напряжению сдвига в целом.
Xie Y1, Wang F, Puscheck EE, Rappolee DA.
Напряжение сдвига при 1,2 дин/см(2) индуцирует активируемое стрессом фосфорилирование протеинкиназы/jun киназы, которое предшествует и вызывает апоптоз у эмбрионов (Xie et al., 2006b, Biol Reprod). Пипетирование эмбрионов необходимо для многих протоколов, от экстракорпорального оплодотворения до сбора эмбрионов перед анализом экспрессии генов с помощью микрочипов. Мы стремились определить, активирует ли пипетирование фосфорилированную MAPK8/9 (ранее известную как активируемая стрессом протеинкиназа/jun-киназа/SAPK/JNK1, 2). Мы обнаружили, что фосфорилированный MAPK8/9, маркер активации MAPK8/9, активируется дозозависимым образом при пипетировании. В то время как эмбрионы с удаленной блестящей оболочкой были более чувствительны к вызванной стрессом летальности, опосредованной усилием сдвига 1,2 дин/см(2), фосфорилированный MAPK8/9 индуцировался при меньшем числе растираний пипеткой у вылупившихся эмбрионов на E4.5. Е4. 5 эмбрионов были более чувствительны к индукции MAPK8/9, чем невылупившиеся эмбрионы на стадии E2.5 или E3.5. Эмбрионы E3.5 также показали дозозависимую индукцию пипетирования белка FOS (ранее известного как c-fos), маркера напряжения сдвига во многих типах клеток. Фосфорилированные MAPK8/9, измеренные у эмбрионов ex vivo от E1.5 до E4.5, экспрессировались на низких уровнях. Эмбрионы, которые были пипетированы в количестве, достаточном для индуцирования фосфорилированных MAPK8/9 и FOS, через 24 часа имели такое же количество клеток, как и необработанные эмбрионы. Это говорит о том, что быстрое фосфорилирование MAPK8/9 из-за кратковременного напряжения сдвига не приводит к долгосрочным негативным биологическим последствиям. Но возможно, что методы, требующие многократного обращения, будут индуцировать MAPK8/9 и вызывать биологические результаты или что другие биологические результаты будут зависеть от небольшого количества переходного напряжения сдвига. Это исследование предполагает, что обработка эмбрионов до экспериментального измерения фосфопротеинов, белков и мРНК сигнальной трансдукции должна выполняться с осторожностью. Действительно, вполне вероятно, что напряжение сдвига может вызвать быстрые временные изменения в сотнях белков и мРНК.
Напряжение сдвига при этом малые размеры обычно измеряют в дин/см2 или Н/м2 = Па. Уравнения между ними: .
Какие повреждения зиготы могут возникнуть при пипетировании?
Используя сканирующую электронную микроскопию, мы обнаружили открытые отверстия на поверхности лизированных яиц, что указывает на нарушение герметичности плазматической мембраны после микроинъекции. В нелизированных яйцах не было обнаружено отверстий, но многие из них имели изменения мембраны, напоминающие зажившие проколы.
Даже небольшое напряжение сдвига 1,2 дин/см2 индуцирует апоптоз за счет пипетирования зигот. Таким образом, у зигот критический уровень напряжения сдвига составляет 1,2 дин/см2, а при пипетировании требуется большее усилие, чем 1,2 дин/см2.
Напряжение сдвига при 1,2 дин/см2 индуцирует активируемое стрессом фосфорилирование протеинкиназы/jun киназы, которое предшествует и вызывает апоптоз у эмбрионов (Xie et al., 2006b, Biol Reprod). Пипетирование эмбрионов необходимо для многих протоколов, от экстракорпорального оплодотворения до сбора эмбрионов перед анализом экспрессии генов с помощью микрочипов. Мы стремились определить, активирует ли пипетирование фосфорилированную MAPK8/9 (ранее известную как активируемая стрессом протеинкиназа/jun-киназа/SAPK/JNK1, 2). Мы обнаружили, что фосфорилированный MAPK8/9, маркер активации MAPK8/9, активируется дозозависимым образом при пипетировании.
Уровень критического напряжения сдвига составляет от 0,01 до 1000 дин/см2 для клеток животных в зависимости от типа и вида клеток. (Я думаю, что среднее значение составляет около 50 дин/см2, но очень трудно провести различие между статьями, в которых упоминаются критические уровни сдвига и наиболее смертельные уровни сдвига, поэтому диапазон и среднее значение могут быть ниже.) Константа смерти (1/ч) ) увеличивается экспоненциально за счет увеличения напряжения сдвига.
Был разработан аппарат для детального исследования влияния напряжения сдвига на прикрепленные клетки BHK. Были изучены усилия сдвига от 0,0 до 2,5 Н м-2. Определяли влияние на жизнеспособность клеток, клеточную морфологию, лизис клеток и размер клеток. Увеличение силы сдвига, а также увеличение продолжительности воздействия вызывали усиление изменений в морфологии клеток и их гибель. Был определен «критический уровень напряжения сдвига».
Повреждение гибридомы мыши, связанное с напряжением сдвига, было исследовано Абу-Ришем и Карги в ламинарных и турбулентных условиях на вискозиметре Серла с коаксиальным цилиндром. Клетки подвергали воздействию напряжения сдвига от 5 до 100 Н/м2 в течение от 0,5 до 3,0 часов. При заданном напряжении сдвига и времени воздействия турбулентный сдвиг был гораздо более разрушительным, чем ламинарный сдвиг, о чем также сообщалось в прошлом для простейших и растительных клеток. В турбулентных условиях повреждение происходило, когда напряжение сдвига превышало 5 Н/м2. Дыхательная активность клеток повреждалась раньше, чем клеточная мембрана, что свидетельствует о передаче стрессового сигнала внутрь клетки. Повреждение клеток следует кинетике первого порядка как в ламинарной, так и в турбулентной среде. Для уровней турбулентного напряжения сдвига от 5 до 30 Н/м2 константа скорости гибели (kd) увеличивалась экспоненциально с увеличением уровня напряжения;
Субконфлюэнтные эндотелиальные культуры, постоянно подвергающиеся воздействию сдвига 1–5 дин/см2, пролиферируют со скоростью, сравнимой со скоростью статических культур, и достигают такой же плотности насыщения (≃ 1,0–1,5 × 105 клеток/см2). При воздействии ламинарного напряжения сдвига 5–10 дин/см2 сливающиеся монослои претерпевают зависящее от времени изменение формы ячеек от многоугольной до эллипсоидальной и становятся однородно ориентированными по мере течения. Регенерация линейных «ран» в сливающемся монослое, по-видимому, зависит от направления приложенной силы. Предварительные исследования показывают, что определенные функции эндотелиальных клеток, включая эндоцитоз жидкости, сборку цитоскелета и нетромбогенные свойства поверхности, также чувствительны к напряжению сдвига. Эти наблюдения предполагают, что механические силы жидкости могут напрямую влиять на структуру и функцию эндотелиальных клеток.
Напряжение сдвига выше 0,25 дин/см(2) приводило к резкой потере подоцитов, но не эпителиальных клеток проксимальных канальцев (клетки LLC-PK(1)) через 20 часов.
Была проведена серия тщательных исследований повреждения крови в ротационном вискозиметре. Особое внимание было сосредоточено на эффектах взаимодействия твердой поверхности, центробежной силы, взаимодействия с поверхностью воздуха, смешивания сдвинутых и не сдвинутых слоев, межклеточного взаимодействия и вязкого нагрева. Результаты показывают, что существует пороговое напряжение сдвига, 1500 дин/см2, выше которого обширное повреждение клеток происходит непосредственно из-за напряжения сдвига, а различные вторичные эффекты, перечисленные выше, незначительны.
Порог напряжения сдвига у некоторых динофлагеллят (микроводорослей) даже ниже, чем у эритроцитов (0,029 Н/м2). Например, уровень непрерывного ламинарного напряжения сдвига всего 0,0044 Н/м2 (что эквивалентно скорости сдвига 2,2 л/с) оказался смертельным для динофлагеллят Gonyaulax polyedra.
Другие типы клеток не столь чувствительны, как клетки животных, и они не обязательно реагируют апоптозом (около 10 дин/см2) на напряжение сдвига, поэтому для их разрушения необходимо использовать силы некроза (около 5000 дин/см2):
cell type size shear sensitivity
microbial cells 1-10μm low
microbial pellets/clumps up to 1cm moderate
plant cells 100μm moderate/high
plant cell aggregates up to 1-2cm high
animal cells 20μm high
animal cells on microcarriers 80-200μm very high
fungi cells 2-10μm moderate/high
Результаты показывают, что клетки яичников китайского хомячка и эмбриональных клеток почки человека вступают в апоптотический путь, когда подвергаются низкому уровню гидродинамического стресса (около 2,0 Па) в колебательном, расширяющемся потоке. Напротив, некротическая гибель преобладает, когда клетки подвергаются гидродинамическим нагрузкам около 1,0 Па при простом сдвиговом потоке или около 500 Па при растяжении.
Чувствительность к сдвигу определяется не только типом и видом клеток, но и многими другими факторами:
Клетки могут быть очень чувствительны к напряжению сдвига, вызванному турбулентным потоком, и не столь чувствительны к напряжению сдвига, вызванному ламинарным потоком.
На основании измерений вискозиметрии ламинарного потока для клеток Morindata citrifolia был предложен уровень критического напряжения сдвига 80-200 Н/м2.
... в то время как для Daucus carota уровень напряжения сдвига 50 Н/м2 был связан с повреждением клеток. В другом исследовании клетки моркови в ламинарном потоке вискозиметра Куэтта теряли способность расти и делиться в диапазоне напряжений сдвига 0,5-100 Н/м2. Активность внутриклеточного фермента снижалась при уровне напряжения сдвига выше 3000 Н/м2, но значительный лизис не происходил до тех пор, пока уровень напряжения сдвига 10 000 Н/м2 не применялся в течение длительного периода времени (> 1 часа).
В отличие от поведения в ламинарном потоке, клетки были весьма чувствительны к турбулентному перемешиванию импеллера. Скорость кончика импеллера ~ 1,1 м / с лизировала значительную часть клеток в течение 40 минут.
Повреждение пузырьков является серьезным (1000 клеток на один пузырек размером 3,5 мм) из-за прилипания клеток к поверхности пузырька и воздействия сильных сил (>1000 дин/см2 в биореакторах с мешалкой). Адгезия и, следовательно, повреждение могут быть уменьшены с помощью поверхностно-активных веществ.
Предполагается, что когда клетки либо прикреплены к разрывающемуся пузырю, либо очень близко к нему, гидродинамических сил, связанных с разрывом, достаточно, чтобы убить клетки.
Все эксперименты проводились с клетками насекомых Spodoptera frugiperda (SF-9), в среде TNM-FH и SFML, с плюроником F-68 и без него. Эксперименты показывают, что примерно 1050 клеток погибает при одном разрыве пузырька диаметром 3,5 мм в среде TNM-FH, и примерно такое же количество мертвых клеток присутствует в восходящей струе. Также было замечено, что концентрация клеток в этой восходящей струе в два раза выше, чем в клеточной суспензии в среде TNM-FH без Pluronic F-68. Считается, что эта более высокая концентрация является результатом прилипания клеток к поверхности пузырьков. Эти клетки уносятся восходящей струей в процессе разрыва пузыря. Наконец, предполагается, что тонкий слой вокруг пузыря, содержащий эти поглощенные клетки, представляет собой «гипотетический убивающий объем», представленный другими исследователями.
Для гибридомной линии сообщалось, что воздействие ламинарного напряжения сдвига (208 Н/м2) в неаэрированном потоке в вискозиметре с конусом и пластиной приводило к существенной потере количества клеток и их жизнеспособности в течение 20 минут. При постоянном воздействии в течение 180 с увеличение напряжения сдвига свыше 100-350 Н/м2 линейно увеличивало разрушение клеток, при этом >90% клеток разрушалось при уровне напряжения 350 Н/м2. Уровни напряжения сдвига, связанные с разрывом пузырьков на поверхности биореактора, могут составлять более 100-300 Н/м2. Эти значения удивительно согласуются со скоростями сдвига, которые повреждали гибридомы в экспериментах с неаэрированным ламинарным потоком.
Пипетки с меньшим отверстием вызывают больше повреждений.
Мы также изучили аспекты процедуры переноса генов, которые могут повлиять на выживаемость, такие как размер пипеток для инъекций и их конусность по отношению к диаметру зиготы, возможная токсичность среды для инъекций, время инъекции и немедленное или отсроченное извлечение пипетки. Единственными факторами, которые значительно влияли на жизнеспособность клеток, были размер и конусность пипетки, а также время инъекции по отношению к первому расщеплению. Это говорит о том, что жизнеспособность зиготы обратно пропорциональна размеру отверстия, проделанного инъекционной пипеткой, и что повреждение мембраны менее успешно восстанавливается по мере того, как оплодотворенная яйцеклетка готовится к делению.
Трудно найти что-либо об уровне напряжения сдвига при пипетировании. Она может быть заведомо больше 1 дин/см2. Он имеет короткую продолжительность (максимум несколько секунд). Я думаю, что следующие факторы могут влиять на уровень напряжения сдвига при пипетировании:
Вероятно, задействовано больше факторов, но я не специалист по пипетированию. ;-) Я согласен с остальными, это, безусловно, зависит от личных навыков, например, любитель может создать огромные пузыри с помощью пипетки, которые могут убить много клеток путем образования и разрушения...
Согласен с Артемом, что это эксперимент, особенно если для вас важен результат. Что вам нужно для создания модели повреждения пипетки, так это уровни напряжения сдвига при пипетировании и критические уровни напряжения сдвига клеток. Я думаю, что трудно спроектировать и провести эксперимент, в котором вы можете измерять уровни напряжения сдвига в своих пипетках, и, насколько я знаю, нет модели потока для пипетирования, поэтому это может быть хорошей темой для диссертации или дипломной работы.
Я знаю, что это ветка двухлетней давности, но я все равно опубликую ее на случай, если кто-то еще ищет этот ответ, как я сегодня вечером. В этой статье, цитируемой ниже, не обсуждаются конкретно наконечники пипеток и иглы, но в ней обсуждается разница во влиянии сужающихся и цилиндрических игл на повреждение клеток. К сожалению, математика в статье мне немного не по плечу (я врач, а не инженер, и они не освещали этот вопрос в медицинской школе), но они обнаружили, что с цилиндрическими иглами результат примерно в 5 раз больше. гибели клеток по сравнению с конической иглой при любой заданной скорости потока и приблизительно в 6-8 раз большем количестве поврежденных клеток. Это, вероятно, было частично связано с необходимостью более высокого давления для увеличения скорости потока в цилиндрических иглах по сравнению с коническими иглами и различиями в сдвиге из-за геометрии.
Биотехнологическая прог. 2011 ноябрь-декабрь; 27(6):1777-84. Влияние геометрии иглы на скорость потока и повреждение клеток в процессе биопроизводства на основе дозирования. Li M1, Tian X, Schreyer DJ, Chen X.
У меня есть реальный биологический пример. упрощенная схема эксперимента: В-клетки, очищенные ex vivo, подвергаются 3 промываниям в PBS (отжим и ресуспендирование), затем они инкубируются in vitro в течение 24 часов и анализируются с помощью проточной цитометрии с использованием Acqua Zombie и PI для исключения мертвых клеток. Эксперимент 1: пипетирование после промывок с помощью 1 мл наконечника Эксперимент 2: пипетирование после промывок с использованием 10 мл пипетки
Выживаемость клеток по данным проточной цитометрии: Эксперимент 1: 9,96% Эксперимент 2: 43,9%
нвя