Проблема с клонированием. Пищеварительный тест в конце клонирования всегда отрицательный.

У меня проблема с клонированием, я пытаюсь клонировать 483 pb в векторе pSecTag с сайтами рестрикции HindIII и BamHI. Вот процедуры, которые я делаю:

• Я ввожу сайты рестрикции BamHI и HindIII в свою вставку с помощью ПЦР с Pfu (полимераза с тупыми концами) и очищаю ее в геле.
• Я клонирую свою вставку в вектор pJET1.2/blunt. Я получаю достаточное количество колоний, и я проверил несколько из них с помощью внутреннего праймера для вставки и векторного праймера с помощью ПЦР. Результаты положительные.

Проблема возникла, когда я переварил свою вставку из pJET и попытался клонировать ее в векторе pSecTag.

• Я расщепляю свою вставку и вектор HindIII и BamHI в Buffer Red в течение 1,5 часов при 37ºC (ферменты). Я очищаю вставку и вектор от геля и проверяю, что все фрагменты имеют правильный размер на геле. Все верно.

• Я выполняю лигирование (ДНК-лигаза Т4), используя вставку 5:1:вектор и менее 100 нг общей ДНК. Лигирование (20 мкл) проводят при 22ºC в течение 30 минут. Я получаю мало или не трансформирующихся колоний. Когда я получаю колонии, я тестирую их с помощью ПЦР:

** • При использовании внутренних грунтовок результат положительный

  • С праймером для вектора результат отрицательный.
  • Самое странное, что когда я использую праймеры pJET, которые не отжигаются в pSecTag, я получаю положительные результаты.**

Для трансформации я использую хемокомпетентный DH5-альфа с тепловым шоком 42°C через 45 секунд. Я протестировал бактерии с плазмидой перед их использованием.

Я меняю условие несколько раз, но всегда получаю один и тот же результат. Я следую всем протоколам, но не получаю свою конструкцию.

Кто-нибудь знает, где проблема? Спасибо.

введите описание изображения здесь

Похоже, вставка все еще в pJET, не так ли? Есть ли шанс, что вы смешали два вектора где-то на этапе очистки после дайджеста? Вместо PCR вы можете попробовать сделать карту ограничений.
Спасибо за ответы Да, вкладыш еще в pJET. В один из случаев, когда это случилось со мной, я переварил это, и полосы соответствовали моей вставке и pJET. Я отправил его последовательно, и результат был таким же. Нет никакой возможности смешать векторы, учитывая проблемы, которые у меня были, я выполнял шаги в разные дни, чтобы избежать каких-либо недоразумений при манипуляции.
Почему вы сначала клонируете его в pJET?
Я не могу переварить свою вставку для ПЦР напрямую, RE не может разрезать.

Ответы (1)

Даже незначительное количество непереваренного вектора загрязнит вашу трансформацию. Вы можете амплифицировать свою вставку из клонирующей плазмиды pJet с помощью ПЦР, а затем расщеплять продукт ПЦР с помощью BamHI и HindIII. Для того, чтобы избавиться от шаблона pJet, либо очистите растворенный вкладыш гелем, подвергните pJet несколько раз, что сокращает его несколько раз (менее предпочтительно), либо поместите все на колонку и надейтесь, что pJet достаточно разбавлен (меньше времени, но немного рискованно).

Еще одна вещь, которую вы можете использовать, это то, что pJet устойчив к ампициллину, в то время как ваш вектор-мишень также устойчив к зеоцину. Если вы добавите зеоцин к E. Coli, он убьет pJet-положительные клоны, сохранив pSecTag-положительные клоны.

Ваша вставка довольно маленькая, поэтому использование немного большего количества ДНК, чем обычно, не повредит.

Если вы можете опубликовать несколько фотографий ваших гелей, это также может быть полезно.

Большое спасибо. Я думал сделать это, амплифицировать с помощью ПЦР, переварить и очистить от геля. Или также попробуйте последовательное пищеварение. У меня должно быть какое-то загрязнение, но трудно понять, где. Я бы загрузил фото гелей, но не знаю как.
Проблема с клонированием. Пищеварительный тест в конце клонирования всегда отрицательный.
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v