Читая газету, я наткнулся на следующую фразу:
Нанчен, Анник и др. «Циклическая AMP-зависимая катаболитная репрессия является доминирующим механизмом контроля метаболических потоков при ограничении глюкозы в Escherichia coli». Журнал бактериологии 190.7 (2008): 2323-2330.
Эти данные о потоках in vivo качественно подтверждаются активностью ферментов in vitro у мутантов Crp и Cya, которые демонстрируют значительно сниженную активность ключевого фермента глиоксилатного шунта изоцитратлиазы ...
Мое понимание экспериментов in vitro таково: они проводятся в искусственных условиях, возможно, только с частью клетки, когда вся клетка потенциально не является живой. Например, мы можем проверить ингибирующую активность определенного фермента метаболитом.
В цитируемой статье рассматриваются эксперименты, из которых получают поток (хемостат) in vivo . Что значит сказать, что активность фермента была протестирована in vitro на мутанте? Когда мы говорим об ответе мутанта с нокаутом одного гена, клетка должна быть интактной, за исключением вставки одного гена, что означает, что ответ происходит in vivo .
Пожалуйста, помогите мне, если я что-то неправильно понимаю.
Ответ уточнен на основе комментария @DurgaDatta
Что значит сказать, что активность фермента была протестирована in vitro на мутанте? Когда мы говорим об ответе мутанта с нокаутом одного гена, клетка должна быть интактной, за исключением вставки одного гена, что будет означать, что ответ происходит in vivo.
Нокауты проводились внутри клеток E. coli , и, как вы отметили, измерения потока проводились in vivo (в клетке) внутри культуры хемостата . Они идентифицировали двух мутантов, Crp и Cya, которые давали гораздо более высокую биомассу. На странице 2326 авторы пишут:
У мутантов Cya (кодирующих аденилатциклазу) и Crp, у которых отсутствует комплекс цАМФ-CRP, активность глиоксилатного шунта in vivo была практически устранена...
Я не знаком с этими генами, но подразумевается, что регуляторы дикого типа имеют комплекс цАМФ-СРБ. Поскольку этот комплекс отсутствует у мутантов, ферменты больше не функционируют по-прежнему. Однако вполне возможно, что какой-то тип взаимодействия мутантов с другими ферментами вызвал наблюдаемый результат in vivo. Поэтому они подтвердили результат, извлекая мутантные ферменты Crp и Cya из клеток и анализируя их ферментативную активность отдельно от других ферментов (in vitro). Техника объясняется в ответе @dgg32.
В своем комментарии к этому ответу вы спрашиваете.
какая разница, взят ли фермент из дикого типа или из мутантного, если это один и тот же фермент?
Это тот же фермент по названию, но не по функциям. У мутантного фермента отсутствует комплекс цАМФ-СРБ, поэтому он не может выполнять ту же функцию, что и фермент дикого типа. In vitro они впервые показали, что активность мутантного фермента была изменена по сравнению с диким типом. Затем они добавили фермент дикого типа в тест in vitro и восстановили нормальную активность дикого типа:
Чтобы убедиться, что наблюдаемые изменения не были вызваны полярными эффектами все еще присутствующего маркерного гена или мутаций вторичного сайта, мы дополнили мутант Crp геном Crp на основе плазмиды и культивировали дополненный мутант в тех же условиях хемостата. Активность ферментов in vitro продемонстрировала, что активность как изоцитратлиазы, так и изоцитратдегидрогеназы восстанавливалась до уровня дикого типа.
Да, это было выполнено внутри культур хемостата, но только с ферментами, а не с живыми клетками E. coli .
Можно провести эксперимент in vitro с клеточными экстрактами. Это означает, что вы разбиваете клетки, кладете их кусочки в реакционный стакан и проводите свой эксперимент. Предполагается, что клеточные молекулы (ферменты, сахара или кофакторы) по-прежнему будут выполнять свои функции, даже если клетки больше нет.
Другими словами, вы использовали мутант для производства нужных вам ферментов (за вычетом нокаутированного), чтобы установить желаемые требования к реакции. Как только продукты есть, вам больше не нужны производители живыми или неповрежденными.
Проверьте часть метода в своей статье и убедитесь, что это так.
ДургаДатта
Майкл С Тейлор