Разрушает ли этанол РНКазу?

Я получил противоречивые советы по этому поводу: некоторые люди считают, что можно удалить загрязнение РНКазой, просто опрыскав стол, пипетки, перчатки и т. д. этанолом. Другие считают, что этанол не разрушает РНКазу, и для предотвращения загрязнения РНКазой необходимы специальные реагенты.

Так удаляет ли этанол загрязнение РНКазой? Если нет, то какой реагент?

См. ответ от шигеты ниже: «ингибирование» - не совсем правильный способ думать об этом, поскольку это может подразумевать определенное взаимодействие, когда речь идет о ферменте.
Хорошо, я изменил формулировку вопроса, чтобы передать необходимость постоянной денатурации.

Ответы (2)

Я думаю, что протоколы по очистке стеклянной посуды не рискуют и просто заботятся о деградации РНК, а не нацелены на один класс ферментов.

Предполагается, что EtOH денатурирует РНКазу и любые другие белки на поверхности.

Другие химические вещества, такие как диэтилпирокарбонат (DEPC), используемый для мытья стеклянной посуды, убивают всю биохимическую активность, реагируя с нуклеофильными фрагментами белка (-OH, -SH-NH( 2/3 )) . (Подробнее см. в комментариях ниже.)

За этими обработками следует нагревание при 300-450 F в течение 2-4 часов. Это не специфическая деконтаминация РНКазой - убивается вся биологическая активность.

Активность РНКазы оценивают не по специфическому обнаружению конкретного фермента, а скорее по расщеплению образца РНК в лабораторных условиях. Таким образом, специфическое ингибирование нецелесообразно — любой белок, который может взаимодействовать с РНК и разрушать ее, в этих протоколах называется РНКазой.

Короче говоря, загрязнение и деградация РНК в лабораторных условиях очень просты. В нашей лаборатории есть специальное рабочее место, предназначенное только для РНК, которое обрабатывается раствором для деградации РНКаз «широкого спектра» перед проведением какой-либо работы с РНК.
Термическая обработка называется депирогенизацией и не только полностью устраняет всю биологическую активность, но также разрушает пирогены (индукторы лихорадки), такие как липополисахарид или эндотоксин.
Спасибо за добавление к этому, ребята. Я думаю, вы видите, как реагенты действительно очищают стекло. Я знаком с протоколами, но сам с РНК не работал.

Вы не хотите только ингибировать или временно денатурировать РНКазы, если вы работаете с РНК, вы должны навсегда инактивировать РНКазы. Я работаю с РНК, и я не видел, чтобы кто-то использовал этанол для удаления РНКаз, я бы не стал доверять его надежной работе. РНКазы — действительно стабильные ферменты, они частично выживают даже при автоклавировании, поэтому я не удивлюсь, если они смогут рефолдироваться после воздействия этанола.

Обычные методы удаления РНКазы:

  • Обработка 0,1% DEPC (нагревание не менее чем до 60 °C или автоклавирование, если возможно, для последующего удаления остаточного DEPC). Нельзя использовать, например, с трис-буфером или чем-то еще, что с ним взаимодействует. DEPC является канцерогеном, поэтому следует соблюдать соответствующие меры безопасности.
  • Все, что сделано из металла или стекла, нагревается до 250 °C в течение примерно 2 часов.
  • 1M NaOH не менее 30 минут (необходимо тщательно промыть, чтобы удалить NaOH)

Вы должны знать, что все, что разрушает РНКазы, скорее всего сделает то же самое с вашей РНК.

Автоклавирование не обеспечивает полной защиты от РНКаз, но все же значительно снижает активность РНКаз . Таким образом, хотя вам не следует полагаться на автоклавирование для избавления от РНКаз, по моему опыту достаточно, если вы начинаете с источника, который вряд ли содержит много РНКаз. Наконечники для пипеток (не вынимайте наконечники из пакета, чтобы свести к минимуму обращение с ними) и вода, отфильтрованная через миллипоры, довольно безопасны после автоклавирования.

Существуют также коммерческие ингибиторы РНКазы, но я использовал их только в тех случаях, когда мне приходилось смешивать РНК и белок, а белок не был полностью свободен от РНКазы.

Разрушает ли этанол РНКазу?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v