Мы подозреваем, что событие двунаправленной транскрипции происходит в локусе нашего организма, где два гена непосредственно примыкают друг к другу. Данные аннотации не установлены. Межгенное расстояние, вероятно, меньше 200 пар оснований.
Два гена экспрессируются в противоположных направлениях по отношению друг к другу. Основываясь на предварительных данных транскриптомики, похоже, что один ген транскрибируется (возможно, 3'UTR?) в соседний ген, что, возможно, приводит к некоторой регуляции транскрипции соседнего гена.
Вот примерная схема того, что, по нашему мнению, может произойти:
------------------------==========gene A================>----------------------
----------------------------------------<====gene B=====-----------------------
Конечно, нам нужно сначала подтвердить это, разработав праймеры, чтобы увидеть, действительно ли происходит избыточная транскрипция.
Если это произойдет, мы намерены провести несколько экспериментов с нокдауном. В нашем организме нет трансгенеза, только РНКи с помощью дцРНК. Можно специфически сбить ген А путем введения дцРНК в 5'-область гена А, которая не перекрывается с геном В. Возможно, это приведет к эктопической/избыточной экспрессии гена B.
Можно ли каким-либо образом сбить ген B, не сбивая ген A? Похоже, что разработка дцРНК для гена B уничтожит и A, и B.
Насколько хорошо аннотирован ген А? Есть ли у вас последовательность гена А (после посттранскрипционных модификаций)? Если вы это сделаете, вы можете заказать его у такой компании, как DNA2.0, и они синтезируют его для вас примерно за 0,35 доллара за основу. Затем вы можете трансформировать клетки этой плазмидой и нокаутировать ген B, вставив некоторую последовательность с перекрытием ~200 оснований.
Кроме того, я думаю, вы можете преобразовать непосредственную стенограмму (без изменений). Он также будет изменен после того, как окажется в ячейке. Но синтезировать будет дольше и дороже, но есть несколько методов, которые вы можете использовать для этого.
Дайте мне знать, если эта идея вам нравится. Я могу дать вам больше информации, если вы заинтересованы.
Если ген B производит белковый продукт, вы можете попытаться сконструировать морфолино против 5'-UTR гена B. Это может предотвратить инициацию трансляции на рибосоме, поскольку морфолино блокирует вход мРНК в рибосому. Вы можете обнаружить это с помощью вестерн-блоттинга.
Если ген B образует своего рода регуляторную РНК, вам нужно нацелить экспрессию гена B на уровне ДНК. Если ген B имеет хорошо установленные сайты сплайсинга, morpholino может мешать энхансерам и сайленсерам сплайсинга и, следовательно, должен продуцировать нефункциональный или поврежденный продукт РНК. Вы можете обнаружить варианты сплайсинга путем амплификации гена B из кДНК.
Теоретически преимущество использования морфолино связано с его одноцепочечной природой. Морфолино, разработанные против гена B, не должны влиять на ген A из-за некомплементарности.
Гергана Вандова
Дамиан Као
пользователь59
{}кнопку, чтобы получить моноширинный шрифт, который будет вести себя последовательно).