Фактическое определение последовательности ДНК методом дробовика?

Я изучаю биоинформатику, и меня смущает секвенирование дробовика. При секвенировании по Сэнгеру мы разбиваем ДНК и используем ddNTP, чтобы определить точное положение каждого нуклеотида. Как именно секвенирование дробовика помогает нам определить структуру последовательности?

Если мы разобьем последовательность случайным образом, а затем соединим ее вместе, глядя на перекрывающиеся части, как это скажет нам, в каком порядке расположены нуклеотиды? Как именно считываются нуклеотиды, чтобы секвенирование дробовика помогло нам?

На вики-странице представлена ​​упрощенная схема (первая таблица и сопроводительный текст). Что именно вам непонятно?
@AliceD По сути, у меня сложилось впечатление, что секвенирование по Сэнгеру не используется в случаях очень длинных цепей ДНК. Последовательность дробовика здесь работает лучше, но я не уверен, как последовательность дробовика выполняет то же самое, что и последовательность сэнгера? Секвенирование по Сэнгеру говорит мне о положении нуклеотидов и, следовательно, о структуре нити ДНК. Как это делает секвенирование дробовика?
Достаточно справедливо, я думаю. Я оставлю это на оценку нашим молекулярным биологам. Я держал свою последнюю пипетку еще в 2001 году Оо Ауч, я старею
Это отвечает на ваш вопрос ?
@AliceD Не совсем так. Я ценю, что вы нашли время, чтобы искать вещи, хотя. Единственное, что для меня имеет смысл, это то, что секвенирование дробовиком включает в себя разрыв слишком длинных нитей ДНК, выполнение на них секвенирования по Сэнгеру, а затем просмотр перекрытия. Но, кажется, в Вики этого не сказано, и там написано МНОГО других вещей, которые я действительно не понимаю, для чего это нужно.
Будет ли ответом на ваш вопрос, если я скажу, что секвенирование дробовика на самом деле не метод секвенирования как таковой, а метод сборки большого количества коротких последовательностей, генерируемых секвенированием по Сэнгеру? Другими словами, чтобы секвенировать длинные молекулы ДНК, вы должны разбить их на короткие фрагменты, с которыми может справиться секвенирование по Сэнгеру, а затем собрать прочтения на основе перекрывающихся последовательностей нуклеотидов.
Я изменил акцент в заголовке, казалось, на сборке, которая не отражала вопроса. Плакат, кажется, знает о компьютерной сборке секвенированных фрагментов, но ему неясно, как определяются идентичность и порядок оснований во фрагментах перед этой повторной сборкой. (Или, возможно, он думал, что это часть процесса повторной сборки, но в любом случае именно это решение ему неясно.)
@ Дэвид Отлично, большое спасибо. Было много вещей, которые меня смущали из-за отсутствия биологического образования, но это очень помогло. Название лучше отражает то, что я хотел.

Ответы (2)

Этот вопрос, по-видимому, смешивает метод идентификации и определения порядка оснований во фрагменте ДНК — секвенирование по Сэнгеру*, метод Максама-Гилберта или более современные методы «следующего поколения» — со стратегией выбора фрагментов для анализа и повторной сборки в более крупные фрагменты. непрерывная последовательность, из которой они были получены, одной из которых является последовательность дробовика.

Последовательность дробовика — это стратегия, в которой выбор фрагментов для последовательности является случайным, метод секвенирования является вопросом выбора (часто это был метод Сэнгера, когда он был впервые разработан), а сборка выполняется компьютерными программами, которые идентифицируют соответствие. растягивается. (Она терпит неудачу — или не совсем успешна — если случайно фрагменты не покрывают всю ДНК с подходящими перекрытиями или существуют определенные типы повторяющихся областей.)

Секвенирование дробовика следует противопоставить тому, что можно было бы назвать стратегиями упорядоченного секвенирования, в которых обычно начинают с рестрикционной карты всей ДНК и первоначально выбирают определенные фрагменты для клонирования и секвенирования (любым методом, который кажется лучшим). На основе последовательности фрагмента можно выбрать дальнейшую последовательность из положения внутри уже секвенированного фрагмента, и эта процедура повторяется. Здесь нет явного этапа сборки, поскольку он присущ выбору фрагментов для последовательности. (Это намного медленнее, чем секвенирование дробовика, и его нельзя автоматизировать, поэтому оно намного дороже. Однако оно более точное.)

Кода

Часть путаницы может возникнуть из-за того, что современные автоматизированные методы секвенирования геномов предназначены для работы со смесью многих неклонированных фрагментов ДНК, поэтому по своей сути включают стратегию секвенирования дробовика. Они склонны использовать технологии, отличные от классического метода Сэнгера. Если для «завершения» отсутствующих или неоднозначных областей генома требуется «ручная» стратегия упорядоченного секвенирования на основе клонов, в этом случае в большинстве случаев будет использоваться метод Сэнгера для определения последовательности. Следовательно, современный писатель может использовать то, что на самом деле является вводящим в заблуждение противопоставлением.

* Фред Сэнгер был выдающимся лауреатом Нобелевской премии, поэтому его фамилия пишется с большой буквы.

Я надеюсь, что это ясно. Если нужно, могу добавить схему.
Это ясно! Спасибо за объяснение. Не могли бы вы предоставить диаграмму, поскольку они обычно значительно улучшают мое понимание.

При секвенировании по Сэнгеру мы разбиваем ДНК и используем ddNTP, чтобы определить точное положение каждого нуклеотида.

Нет. Секвенирование по Сэнгеру не делает этого. Результатом одной реакции секвенирования по Сэнгеру является цепочка нуклеотидов длиной около 700–1200 п.н. В этом нет ничего, что по своей сути придавало бы этой струне позицию.

«Дробовик» просто означает, что вы не используете в своих интересах какую-либо известную картографическую информацию, чтобы нацелить свои реакции секвенирования; вы упорядочиваете все случайным образом, и позволяете компьютеру разобраться, что с чем совпадает.

Фактическое определение последовательности ДНК методом дробовика?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v