какие процедуры я бы использовал для выделения и амплификации интегразы? Если я пытаюсь изучить фермент интегразу, обнаруженный в ВИЧ, как бы я 1) разрушил вирусную капсулу, чтобы высвободить ее содержимое. 2) отделить интегразу от других ферментов и вирусной ДНК. 3) сделать копии фермента для тестирования. Любая помощь будет принята с благодарностью!
Каждый вирус будет содержать чрезвычайно малое количество фермента (вероятно, в лучшем случае несколько отдельных молекул); собрать и сконцентрировать достаточное количество вирусов для извлечения значительного количества фермента было бы долго и сложно, если вообще возможно.
Обычная стратегия в исследовательских лабораториях состоит в том, чтобы клонировать последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую этот белок (либо путем прямой амплификации из ВИЧ-инфицированной клетки, либо путем синтеза фрагмента ДНК in vitro ) и интегрировать ее в вектор экспрессии, то есть более крупный фрагмент ДНК, обычно кольцевой, пригодный для интеграции в клетку-хозяина (человека или даже бактерии) и несущий последовательности, необходимые для персистенции и экспрессии генов. Таким образом, вы можете производить тысячи копий интересующего вас фермента в каждой клетке, а затем очищать значительное количество интегразы для ее изучения.
Чтобы облегчить очистку, обычно к гену добавляют последовательность, кодирующую «метку очистки», то есть несколько дополнительных аминокислот, обладающих особыми свойствами, облегчающими очистку конечного белка. Очень часто используются отрезки из 6-8 остатков гистидина. Предполагается, что белок, несущий эту метку, после очистки будет иметь активность, аналогичную природному ферменту.
Дэйвид