Как очистить РНК после гель-электрофореза, чтобы удалить остаточный акриламид?

Иногда я использую денатурирующий гель-электрофорез в препаративном масштабе для очистки РНК, полученной в результате транскрипции in vitro. Основная проблема заключается в том, что образец после извлечения из геля все еще содержит значительное количество акриламида или олигомеров/полимеров акриламида.

Замена буфера с помощью Vivaspins не удаляет его надежно, осаждение РНК также только уменьшает количество, но не может полностью удалить акриламид.

В некоторых случаях акриламид не сильно мешает последующим экспериментам, но есть некоторые эксперименты, которые не будут работать с акриламидом в образце.

Какие есть варианты очистки РНК после гель-электрофореза, чтобы надежно удалить акриламид из образца? Желательно, чтобы они были простыми и быстрыми, а не чем-то вроде полного цикла FPLC/HPLC.

Могу я спросить, зачем вам нужно очищать транскрибированную in vitro РНК? Я делал мРНК с помощью IVT и получил хорошие результаты без какой-либо очистки, кроме экстракции фенолом: хлороформом и осаждения изопропанолом.
@ user137 Я использую саму РНК для экспериментов с ЯМР, она мне нужна в другом буфере и без ДНК и белка, чтобы получить спектры хорошего качества. И все остальное, что все еще там, вероятно, будет перекрывать некоторые сигналы РНК.
Сколько РНК нужно для ЯМР? Я всегда слышал, что для хорошего сигнала ЯМР нужно много материала.
@ user137 В зависимости от того, что именно вы хотите сделать, вам нужно около 0,2–1,0 мМ белка или РНК в образце в объеме 300–500 микролитров. И для многих экспериментов вам также понадобится 13C и/или 15N-меченый.
@MadScientist Может быть, я неправильно рассчитал, но 500 мкл 1 мМ моей мРНК (1860 оснований) будут 300 мг РНК. Даже если 300 мкл 0,2 мМ будут примерно 36 мг РНК. При хорошей реакции транскрипции in vitro я могу получить 200 мкг РНК. Очевидно, что для такой же молярности короткой РНК потребуется гораздо меньшая масса.
@ user137 РНК, которую вы будете исследовать с помощью ЯМР, обычно имеет длину около 15-150 нт, с помощью ЯМР вы не увидите ничего большего. И мы просто делаем транскрипцию in vitro в большем масштабе, обычно около 10-30 мл. РНК также почти всегда измеряют в пробирках Шигеми, поэтому объем составляет 300 мкл, а концентрация 1 мМ идеальна, но не всегда можно получить столько.

Ответы (1)

Если вы не хотите использовать акриламид в своем препарате, не используйте его, так как в растворе всегда будет остаток. И полностью от него не избавишься, так как он хотя бы частично соосаждается с нуклеиновыми кислотами (для этого используется в качестве соосаждающего агента).

Я думаю, что лучшим решением будет использование хроматографии, эксклюзионной или заряженной смолы. Дополнительные сведения см. в этих двух документах:

Мы также используем хроматографические методы, но гель-очистка имеет определенные преимущества, такие как лучшее разрешение. Мне не нужно полностью избавляться от акриламида, достаточно уменьшить его значительно ниже концентрации РНК.
Гель проще и быстрее, хроматография имеет лучшее разрешение и занимает больше времени. Теперь нужно выбрать, что важнее...
Я подозреваю, что после прогона останется неполимеризованный акриламид. При нагревании акриламид должен разлагаться на газообразные продукты (аммиак, водород и монооксид углерода). Смотрите здесь . Я не уверен насчет термического разложения (нет надежной ссылки).
Как очистить РНК после гель-электрофореза, чтобы удалить остаточный акриламид?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v