Длительное хранение уже отлитых гелей агарозы и бромистого этидия.

Я придумал то, что мне показалось умной идеей: хранить агарозные гели, которые я заливаю, и резать только столько дорожек, сколько мне нужно, чтобы запустить позже, сводя к минимуму трату агарозы (и потраченных усилий/времени), когда мне нужно сделать много электрофорезов. с использованием небольшого количества дорожек.

Я понял, что со временем EtBr диффундирует из моего геля в буфер, в котором хранятся гели. мкл EtBr в буфер, полагая, что теперь концентрации равны и чистой диффузии не будет.

Однако через несколько недель я заметил, что сигнал EtBr от геля сильно ослаб. Что я могу сделать, чтобы исправить это? Я вижу следующие варианты:

  • Используйте более высокую концентрацию EtBr в буфере (сколько?)
  • Еженедельно меняйте буфер, каждый раз добавляя свежий EtBr.
  • Накройте прозрачный контейнер алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить гипотетическое фотообесцвечивание.

Какой из них, скорее всего, решит мою проблему? Должен ли я просто сдаться и выбросить гели старше одного или двух дней (я хочу избежать этого варианта из-за ведения записей, необходимых для отслеживания времени последнего изготовления геля)?

То, что я видел, это держать бутылку с агарозным гелем, затем нагревать его, чтобы расплавить, наливать то, что вам нужно, в гель-кастер, добавлять этидий. Таким образом, ваш большой запас геля не будет загрязнен этидием, и вам не придется беспокоиться о потере сигнала этидия.
@ user137 Я сохраняю литые гели, чтобы избежать хлопот с плавлением и литьем геля каждый раз, когда я хочу запустить несколько образцов. Бутылка с агарозой избавляет меня только от работы по взвешиванию агарозы, что по сравнению с ней совершенно незначительно.
наблюдали ли вы снижение сигнала при использовании той же ДНК-концентрата или конструкции после запуска ее несколькими неделями позже в геле, содержащем ранее не обработанную полосу ДНК? Я думаю, что EtBr может отбеливать фотографии, поэтому просто используйте свежий буфер со свежим EtBr. Даже с запасом EtBr вы должны обернуть его вокруг фольги! Старые гели, как правило, не годятся, так как по моему опыту они могут стать довольно твердыми и хрупкими, поэтому всегда лучше использовать свежие гели.
@Superbest Вы можете хранить предварительно отлитые гели без этидия, а затем пост-окрашивать, но в конечном итоге у вас будет больше отходов этидия, о которых нужно беспокоиться.
@Bez Да, я сначала делаю гель с обычным EtBr, лунками и т. Д., Затем помещаю гель в буфер TAE с EtBr в буфере, держу его там несколько недель, запускаю. Я сравниваю равные количества ладдеров, и кажется, что мой сигнал от двухнедельного или около того геля составляет, может быть, 30% от свежего (или 1-2-дневного) геля.
@ user137 Да, тоже вариант. Тем не менее, я хочу провести специальное «предварительное окрашивание», то есть нанести EtBr после того, как гель полностью отлит и готов к использованию, но до того, как он будет фактически загружен ДНК. Я только спрашиваю, как сделать это с минимальной потерей сигнала (ваши предложения имеют смысл, но какие из них мне действительно нужно сделать?). Если это невозможно, приемлемо и хорошее объяснение того, почему.
Мне сказали, чтобы сохранить гель, я должен держать его в холодном и темном месте, обернутым вокруг мокрого полотенца! Но я думаю, что проблема в фотообесцвечивании! поэтому замочите его в новом буфере со свежим EtBr после того, как вы прогоните свои образцы. Разве у тебя не появилась плесень в буфере с гелем в течение нескольких недель?
Да ладно @Superbest, на взвешивание и заливку гелей уходит ничтожно мало времени. Налейте его, прежде чем успокоиться, чтобы проверить почту или Facebook :P
@Superbest, посмотри мой ответ, мне приходилось с этим сталкиваться раньше. Кроме того, если вы пытаетесь сохранить гели после того, как они были запущены, вы можете использовать сушилку для геля (одна из тех кухонных принадлежностей в вакуумных пакетах для пищевых продуктов, которые вы можете купить в Target work, а также коммерческие сушилки для геля за 5000 долларов).
@WYSIWYG правда, это тривиально, но если вы готовите много гелей, например, для 400 студентов для учебной лаборатории бакалавриата, их намного проще отлить, разрезать и хранить.

Ответы (3)

Для увеличения срока хранения: после застывания геля смочите его бегущим буфером. Оберните гель поливинилхлоридом. Поместите в пластиковый контейнер с крышкой. Хранить в холодильнике в темноте. Он продлится год, пока вы повторно увлажняете его буфером каждый раз, когда вы к нему обращаетесь. Не держите его погруженным в буфер, так как etbr рассеется. это, вероятно, причина вашей проблемы. Обратите внимание, что когда вы заказываете сборные гели (либо агарозные, либо акриламидные), они запечатаны, и для поддержания их гидратации добавляется лишь небольшой объем буфера. Кроме того, etbr и ЭДТА в буфере помогают предотвратить рост плесени, хотя я несколько раз наблюдал рост черной плесени примерно в год.

Вы всегда можете добавить буфер с помощью etbr, добавив его непосредственно в камеру для электрофореза, прежде чем запускать гель (etbr даже не нужно даже находиться в геле, чтобы он работал), хотя я считаю, что вы получаете немного больше чувствительности с etbr в геле. Если вы добавляете его, обязательно перемешайте и оставьте на 20 минут, чтобы etbr рассеялся.

Если вы пытаетесь сократить расходы, вы, вероятно, используете агарозу более высокого качества, чем вам действительно нужно для приложения, которое вы делаете, поэтому я бы взглянул на это.

Если вам в конечном итоге потребуется хранить гели для работы с РНК, добавьте старый добрый отбеливатель Clorox до конечной концентрации 1% в ваш гель TAE сразу после разогрева в микроволновой печи. Звучит безумно, но работает очень хорошо. Вы полностью ингибируете РНКазу, и ваши полосы РНК будут хорошо выглядеть!!! Отбеливатель также помогает при хранении геля.

ОП уже заявил, что концентрации EtBr внутри и снаружи геля одинаковы.
@MarchHo Конечно, то, что они идентичны, не означает, что не будет чистой диффузии.
Я также могу подтвердить хранение отбеливающего геля - не только это, но, несмотря на то, что я не позаботился о том, чтобы обесцвечивать гель вдали от загрязнителей РНКазы (хранение в той же коробке, что и обычные гели, грязный резервуар для электрофореза), моя РНК работала и окрашивалась просто отлично .

Думаю, у меня есть доказательства того, что ключевым фактором является свет.

После того, как я задал этот вопрос, я сменил буфер на свежий TAE-EtBr (той же концентрации, что и в моих гелях), переместил свои гели из хорошо освещенного места в закрытую непрозрачную коробку, чтобы они оставались в темноте. Через 1 неделю я пробежал одинаковое количество своей лестницы в сохраненном геле, а также в свежем геле. Результаты ( старый гель слева, новый гель справа) показывают очень небольшую разницу в сигнале — я делаю вывод, что блокировки света достаточно.

Я не совсем уверен, что вы делаете. Вы каждый раз запускаете весь гель и отрезаете использованные дорожки или только кладете в бак те дорожки, которые хотите, а остальные оставляете снаружи?

Если первое, то бромид этидия будет выщелачиваться из геля, потому что он заряжен положительно, поэтому каждый раз, когда вы подаете на него ток, часть его уходит.

Если последнее, я не уверен, почему вы вообще храните свой гель в буфере. Заверните его в пищевую пленку, чтобы предотвратить высыхание, и храните вдали от ультрафиолетового излучения, чтобы избежать деградации этидия.

Однако, честно говоря, я не уверен, почему вы думаете, что это сэкономит вам много времени? Вы можете хранить предварительно расплавленную агарозу с добавлением бромистого этидия в течение нескольких недель, а заливка свежего геля не займет много времени.

Это последнее. У меня есть большой гель, хранящийся в контейнере (его легче открывать и закрывать, чем пленку), и я отрезаю нужные мне дорожки и запускаю только эти дорожки.
Длительное хранение уже отлитых гелей агарозы и бромистого этидия.
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 1v