Можно ли сделать анаэробные среды слишком восстановительными?

Я изо всех сил пытался вырастить анаэроб ( P. gingivalis ), я принимаю все меры предосторожности, чтобы условия культивирования не содержали кислорода, мне было интересно, могут ли условия быть настолько суровыми, что они подавляют микробный рост облигатных анаэробов.

Чтобы сделать жидкую среду, я делаю следующее:

  • TSB с добавлением дрожжевого экстракта
  • плюс 0,5 г/л L-цистеина HCl в качестве восстановителя
  • плюс резазурин в качестве окислительно-восстановительного индикатора
  • барботируют азотом, пока резазурин не станет полностью бесцветным
  • добавить гемин (5 мг/л) и витамин К1 (1 мг/л) из исходных растворов (1 мл/л гемина в воде, 200 мкл/л витамина К1 в этаноле)
  • отфильтровать - ввести эту среду в стеклянные пробирки, из которых был удален газ (это происходит в анаэробной вытяжке)
  • все материалы (шприцы, иглы, фильтры, пробирки) перед использованием были оставлены в анаэробном боксе, чтобы в них/на них не осталось остаточного кислорода
  • заменить свободное пространство газовой смесью 80:10:10 N 2 :CO 2 :H 2

У меня нет никакого роста после более чем 72 часов при 37 o C.

Другие протоколы, которые я нашел , гораздо более расплывчаты/слабы в отношении удаления кислорода, многие просто говорят, что следует добавить цистеин, а среду следует инкубировать в анаэробном боксе в течение 24 часов с открытой крышкой перед использованием. Это заставило меня подумать, что, возможно, я удаляю слишком много кислорода.

Что вы думаете?

Для справки, сегодня я получил культуру, я проверил рН после промывки и заметил, что он был немного низким (6,6, на самом деле должно быть 7,4), поэтому я сбалансировал его примерно до 8,0 перед промывкой, и в итоге рН составил около 7,0. Я думаю, что мог бы добиться большего успеха и иметь среду с конечным pH 7,4, но, эй, это работает!

Ответы (1)

Я заметил, что вы не указываете pH, что может быть важно.

Я не знаю, можно ли добавить слишком много восстановителя (подозреваю, что нет), но часто требуется большой избыток, поскольку константы равновесия для реакций дисульфидного обмена обычно близки к единице (см. Cleland , 1963).

Я также не знаю, имеет ли что-либо из следующего отношение к вашей проблеме (опять же, я подозреваю, что нет), но я хочу кратко прокомментировать два аспекта использования тиолов в качестве восстановителей в целом.

Во-первых, окисленная (дисульфидная) форма тиолов может реагировать с сульфгидрилом белка. Используя β-меркаптоэтанол в качестве примера ( Scopes , 1993, стр. 320), может произойти что-то вроде следующего, когда восстанавливающий агент становится (обратимо) связанным с белком. Если реактивный сульфгидрил находится в активном центре фермента, это может привести к инактивации.

(1) 2 ЧАС С С ЧАС Икс 2 − С ЧАС Икс 2 О ЧАС + О Икс 2 ⟶ ЧАС О С ЧАС Икс 2 С ЧАС Икс 2 − С − С − С ЧАС Икс 2 С ЧАС Икс 2 О ЧАС + ЧАС Икс 2 О Икс 2

(2) ЧАС О С ЧАС Икс 2 С ЧАС Икс 2 − С − С − С ЧАС Икс 2 С ЧАС Икс 2 О ЧАС + ЧАС С − белок ↽ − − ⇀ ЧАС С С ЧАС Икс 2 − С ЧАС Икс 2 О ЧАС + ЧАС О С ЧАС Икс 2 С ЧАС Икс 2 − С − С − белок  

Как уже говорилось, константы равновесия для реакций тиолового обмена часто близки к единице ( Cleland , 1963).

(3) р Икс 1 − С − С − р Икс 2 + р Икс 3 − С ЧАС ↽ − − ⇀ р Икс 1 − С − С − р Икс 3 + р Икс 2 − С ЧАС  
По этой причине многие белковые химики предпочитают использовать в качестве восстановителя дитиоловые аналоги треитола (дитиотреитол, ДТТ или реактив Клеланда ) или эритрит, поскольку окисленная форма этих соединений представляет собой циклические дисульфиды, где константа равновесия смещена вправо ( см. Клиланд , 1963).

Есть еще вопрос стабильности.

Период полураспада тиолов в растворе заметно зависит от pH и температуры, как показано в таблице ниже. Период полураспада β-меркаптоэтанола при pH 6,5 и 20 ℃ превышает 100 часов, а при pH 8,5 и 20 ℃ — всего 4 часа.

 

stevens_stevens_price о стабильности дисульфидов

Приведенная выше таблица была взята из Stevens, R, Stevens, L & Price, NC (1983) «Стабильность различных тиоловых соединений, используемых при очистке белков », опубликованной в (ныне несуществующем) Biochemical Education. Полная версия статьи находится в свободном доступе в формате pdf на веб- сайте Wiley .

Спасибо, это действительно интересно, я рассмотрю возможность использования DTT в качестве восстановителя по умолчанию. Я думаю, в конце концов, проблема заключалась в pH, я бы отрегулировал его до 7,4 перед сортировкой, но после барботажа он упал примерно до 6,6. Я не уверен, почему это могло быть, может быть испарение, или некоторое количество CO2 могло раствориться. В любом случае, кажется, что Porphyromonas gingivalis предпочитает рН около 7,5.
Я думаю, что согласен с вами: вы, вероятно, не можете иметь анаэробную среду, которая является восстановительной для облигатного анаэроба. Так что я считаю этот вопрос решенным.
Можно ли сделать анаэробные среды слишком восстановительными?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v