Зачем анализировать транскриптом, а не протеом?

В: Почему бы просто не извлечь белки…

A: Это не просто вопрос извлечения белков, вам нужно будет разделить их, а затем изолировать каждый из них. В настоящее время нет практического способа сделать это, скажем, для 10 000 белков, которые в любом случае могут иметь несколько форм. Прелесть метода RNAseq в том, что он не требует физического разделения или выделения транскриптов.

Подход, который, скорее всего, будет полезен, заключается в идентификации и количественной оценке белков in situ , но это все еще далеко от требуемой полноты и чувствительности.

В: …упорядочить их…

A: Секвенирование белков медленное и сложное. Его нельзя применять в массовом масштабе, в отличие от секвенирования ДНК-копий РНК-транскриптов. Другие методы идентификации, основанные на физическом поведении (миграция или положение при элюировании), являются более перспективными и направлением, которому, вероятно, будут следовать.

В: …определить их количество…

A: Даже это сложно, например, когда вы элюируете белки из гелей. Напротив, методология RNAseq просто подсчитывает транскрипты. (Но наиболее вероятным направлением этого будет количественный анализ по высоте пика, без разделения или выделения, как в метаболомике, или по интенсивности некоторого сигнала от белка, иммобилизованного в геле, при окрашивании чего-то более сложного.)

Так что, в общем, вы делаете анализ белка на отдельных интересующих вас белках, тогда как вы можете сделать анализ РНКсек всех транскриптов в биологическом образце, а затем отправиться на рыбалку (по результатам, а затем на озеро, если это ваше). предмет).

Почему бы просто не извлечь белки и не секвенировать их, не определить их количество, не проанализировать и не сделать выводы?

Потому что протеомика действительно сложна. Чтобы привести один пример, не существует белкового эквивалента ПЦР . Это означает, что нет простого способа выбрать и амплифицировать конкретный белок из сложной смеси. Изобретение ПЦР сыграло ключевую роль в быстром развитии геномики за последние 40 лет.

Масс-спектрометрия является основным инструментом для высокопроизводительной протеомики, а масс-спектрометрический анализ по-прежнему очень сложно проводить и еще труднее интерпретировать .

Хотя вы правы в том, что «конечным результатом» всегда является белок и что функциональный анализ на уровне мРНК может игнорировать трансляционный контроль, есть веские причины для анализа транскриптома:

1) Как вы сказали, с мРНК может происходить многое: она может деградировать, транслироваться или также подвергаться репрессии на какое-то время, пока она снова не активируется. Большинство этих контрольных процессов довольно сильно влияют на «конечный выход белка», но их гораздо легче изучать на уровне мРНК/транскриптома (поскольку именно там они и происходят).

2) Анализ транскриптома на уровне всего генома технически относительно прост: технология секвенирования к настоящему времени довольно развита, и существует множество различных протоколов, созданных для просмотра не только уровней экспрессии отдельных мРНК, но и других вещей, таких как стабильность, процессинг (т.е. сплайсинг). или полиаденилирование), а также трансляцию мРНК. Все это также может быть сделано с относительно низкими затратами материала.
С другой стороны, анализ белков требует использования масс-спектрометрии, которая не обязательно является такой же мощной или чувствительной, как секвенирование.

What are the compelling arguments to study the transcriptome to understand biological processes?

Существуют убедительные аргументы в пользу изучения транскриптома, но они зависят от вопроса исследования. Исследования, направленные на активацию факторов транскрипции, должны использовать данные транскриптома, как и исследования событий процессинга РНК (сплайсинг, процессинг пре-мРНК, стабильность). Вам также нужны данные транскриптов при изучении транскриптов РНК, которые не кодируют белки.

Я не думаю, что есть убедительные биологические аргументы в пользу изучения транскриптома, если вы хотите узнать об экспрессии генов, кодирующих белок, в тканях или клетках. Вы должны сосредоточиться на белках, поскольку они являются последним шагом в экспрессии генов, кодирующих белки. Соответствие между уровнями транскриптов, кодирующих белок, и их белком может быть превосходным, но может быть и очень плохим. Данные расшифровки не могут разделить эти группы. По глобальным оценкам, уровни транскриптов объясняют только около половины вариаций уровней белка. Я думаю, что такой уровень неточности неприемлем, когда есть жизнеспособная альтернатива.

Why not just extract the proteins and quantify them?

Существуют физические и исторические ограничения для глобального количественного определения белков. Я собрал пару ограничений, которые считаю наиболее важными. Масс-спектрометрия (МС) в настоящее время является методом выбора для высокопроизводительного количественного определения белка. Такие методы, как секвенирование по Эдману или иммунологическое обнаружение, имеют гораздо меньшую производительность.

Существуют физические ограничения, которые в настоящее время мешают MS выполнять количественные глобальные измерения с использованием интактных белков. Очень жаль. Глобальные измерения в настоящее время выполняются путем количественного определения пептидов из расщепленных белков с использованием системы жидкостной хроматографии для подачи пептидов в МС (ЖХ-МС). Пептиды идентифицируют, а затем относят к белку или группе белков. Конечные результаты надежны, и большинство из них разрешается для идентификации отдельных белков. Некоторые пептиды разрешаются только для идентификации группы белков. В большинстве случаев это незначительное ограничение.

Проведение глобальных измерений количества белка стало возможным только в последнее десятилетие, в то время как глобальные измерения стали рутинными только с появлением сверхвысокопроизводительных ЖХ в сочетании с новейшими масс-спектрометрами. Многие ученые-исследователи будут иметь доступ к этой технологии через свои местные центры масс-спектрометрии, но большинство из них этого не осознают. Эта новизна - большая часть причины, по которой это менее распространено.

Summary

Я думаю, что количественная оценка белков методом ЖХ-МС будет чаще использоваться вместо данных транскриптов в течение следующих нескольких лет. Это связано со способностью современных инструментов ЖХ-МС давать лучшие ответы в биологических системах, которым требуется информация на уровне белков. Рецензенты начнут требовать этого. Я думаю, что в течение следующего десятилетия высокоэффективная ЖХ-МС может стать достаточно дешевой, чтобы даже заменить низкопроизводительные иммунологические методы, такие как иммуноблоттинг и иммунофлуоресценция.

Есть один аспект, который не был подробно описан: транскриптом намного дешевле протеома . Анализ одного отдельного белка в ЖХ-МС/МС может стоить столько же, сколько транскриптом. И если вы принадлежите к тем небольшим группам с недостаточным финансированием, которые работают с немодельными организмами, которые действительно интересны, но не очень полезны для лечения рака, то у вас нет выбора.