Я хотел бы повторно использовать набор данных, созданный LIGR-seqдля предсказания вторичной структуры нкРНК в стиле PARISметода.
На первый взгляд методы кажутся мне очень похожими: использование АМТ для сшивки, лигирование химерных прочтений, секвенирование.
Может ли кто-нибудь указать на принципиальные различия между этими методами?
Соответствующие документы, которые я нашел:
LIGR-seq- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S109727651630106X
PARIS- https://www.cell.com/fulltext/S0092867416304226
Первоначально опубликовано на Biostars ( https://www.biostars.org/p/9507932/ )
LIGR-последовательность
LIGR-seq (рис. 1A) использует перекрестное связывание дуплексов РНК in vivo с использованием модифицированного производного псоралена 4'-аминометилтриоксалена (АМТ), которое интеркалирует в дуплексы РНК и при УФ-облучении 365 нм генерирует межцепочечные аддукты между соседними пиримидиновыми основаниями. Кальве и Педерсон, 1979). После лизиса клеток и ограниченного расщепления одноцепочечной эндонуклеазой S1 свободные выступы РНК, прилегающие к дуплексам, лигируют с использованием циркРНК-лигазы. Эта лигаза катализирует АТФ-зависимое лигирование проксимальных концов РНК и обладает оптимальной активностью при повышенных температурах, снижающих гибридизацию РНК. РНКаза R, 3'→5' экзорибонуклеаза, которая расщепляет линейные и структурированные РНК (Vincent and Deutscher, 2006), затем используется для расщепления несшитой РНК, тем самым обогащая AMT-сшитые дуплексы (рис. 1А и S1). После реверсии поперечных связей с помощью облучения с длиной волны 254 нм образцы РНК подвергают высокопроизводительному секвенированию для обнаружения химер, образованных лигированием. Для оценки фоновых артефактов лигирования параллельно готовят несшитые («–AMT») образцы, а нелигированные образцы используют для определения относительной экспрессии транскриптов, образующих химеры, для последующей нормализации и анализа.
Резюме
Сшивание AMT ⟶ лизис клеток ⟶ расщепление эндонуклеазой S1 ⟶ лигирование РНК-РНК с помощью циркРНК-лигазы ⟶ расщепление несшитой РНК РНКазой R ⟶ реверсирование сшивания ⟶ подготовка библиотеки секвенирования (лигирование адаптера, обратная транскрипция и т. д . )
ПАРИЖ
Клетки HeLa, HEK293T и mES обрабатывали АМТ или без него и сшивали УФ-излучением с длиной волны 365 нм. Клеточные лизаты расщепляли нуклеазой S1 и очищали РНК с использованием TRIzol. Очищенную РНК далее расщепляли с помощью ShortCut RNase III до более мелких фрагментов. РНК разделяли в 12% нативном полиакриламидном геле, а затем срезы геля первого измерения дополнительно подвергали электрофорезу в геле второго измерения, 20% денатурированном мочевиной. Сшитую РНК выше главной диагонали элюировали, близко лигировали с помощью Т4 РНК-лигазы I и фотообращали с помощью УФ-излучения с длиной волны 254 нм. Затем лигированные по близости молекулы РНК лигировали в адаптеры со штрих-кодом и преобразовывали в библиотеки для секвенирования Illumina.
Резюме
Кросслинкинг AMT ⟶ лизис клеток ⟶ расщепление эндонуклеазой S1 ⟶ очистка TRIzol ⟶ расщепление ShortCut РНКазой III ⟶ 2D очистка геля ⟶ лигирование РНК-РНК с помощью T4 РНК-лигазы 1 ⟶ реверсирование сшивки ⟶ подготовка библиотеки секвенирования (лигирование адаптера, обратная транскрипция и т. д . )
Что касается захвата взаимодействий РНК-РНК, эти методы по существу одинаковы. Учитывая, что обе статьи были опубликованы в журналах Cell Press на одной неделе, они, вероятно, разрабатывались одновременно в конкурирующих лабораториях. Возможно, редакторы координировали публикацию, чтобы ни одна из групп не почувствовала, что их «обманули».
Из того, что я могу сказать, основное различие заключается в том, как методы различают интеракторы РНК in vivo от временных событий гибридизации РНК-РНК, которые происходят в ходе протоколов. В LIGR-seq они включают несшитый («–AMT») контроль, чтобы они могли отличать истинные взаимодействия от фонового шума, ища химеры лигирования, которые обогащены образцами +AMT по сравнению с –AMT. В PARIS второе измерение 2D-геля состоит из 20% мочевины, которая служит для денатурации любых несшитых молекул dsRNA перед лигированием; см. полные методы для более подробной информации:
Срезы геля каждой дорожки были встроены и полимеризованы в верхней части полиакриламидного геля второго измерения, денатурированного 20% мочевиной-TBE ... Гель второго измерения имеет более высокую температуру из-за высокой мощности, а высокая температура облегчает денатурацию фрагментов дцРНК. .
Также может быть разница в распределении длин химерных молекул РНК, полученных в конце каждого метода, поскольку LIGR-seq и PARIS используют разные ферменты РНКазы с разными параметрами расщепления.