Активны ли рестриктазы при -20°С?

Я расщепил свою ДНК с помощью фермента NotI и поместил ее в морозильную камеру при температуре -20 °C, не инактивировав ее нагреванием. Могут ли рестриктазы работать при -20°С? Стоит ли ожидать активности STAR?

Я бы по-прежнему рекомендовал инактивировать фермент или очистить реакцию после оттаивания.
что такое звездная активность? Пожалуйста, избегайте аббревиатур amap thnk y otherws t bcms unintellgbl
@AliceD Звездная активность — довольно распространенный термин. Это относится к неспецифическому расщеплению ферментами рестрикции.
@AliceD Звездная активность - это не аббревиатура, это просто жаргон рестрикционных ферментов. -редактировать- ниндзяд.
прописные буквы сделали это похоже на аббревиатуру :) Спасибо, ребята

Ответы (2)

Ферменты имеют температурные оптимумы в зависимости от организма, из которого они были выделены. Так что я бы предсказал, что при -20 °C активности практически нет. Другое соображение заключается в том, что реакции, вероятно, будут заморожены, что ограничит диффузию, а также замедлит ее. Но настоящий вопрос: чего вы боитесь? Просто звездная активность? Даже если бы была звездная активность, не повлияло бы это отрицательно на ваши эксперименты?

Не знаю, у меня никогда раньше не было звездной активности. Ваш ответ имеет смысл, и я тоже так думаю, но я разместил вопрос здесь, потому что в Интернете не было ответа на него, и я подумал, что, может быть, у кого-то здесь есть опыт в этом.
Как насчет этой бумаги? ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2396408/pdf/gkn182.pdf
@mdperry Вы должны обновить это в своем ответе и, возможно, включить некоторые выдержки из него, это отличное дополнение.

Хотя маловероятно, что фермент будет заморожен, есть более эффективные методы предотвращения звездной активности.

1: Если вы проводите реакцию на ПЦР-аппарате, вы можете запрограммировать его перед расщеплением на нагрев до 65 градусов в течение 10 минут после предполагаемого времени расщепления, чтобы инактивировать NotI нагреванием. Поскольку NotI является термолабильным ферментом , это предотвращает активность звезды, денатурируя ее.

2: Вы можете использовать NotI-HF , который был разработан NEB для значительного снижения активности звезд и поэтому может инкубироваться при 37°C в течение ночи.

3: Вы можете провести гель-очистку или провести «очистку ПЦР» на ваших переваренных образцах ДНК, это также удалит любой присутствующий белок и, следовательно, предотвратит звездную активность.

@WYSIWYG Почему пугающие кавычки?
Кроме того, вы можете запустить реакцию в пробирках для ПЦР в термоциклере. Просто выберите желаемую температуру, а затем увеличьте ее до 10 минут при 65°C. Никаких дополнительных действий не требуется и очень удобно.
@ Крис Это было именно то, что я имел в виду. Извините за неясность. Отредактированный ответ.
@Chris WYSIWYG отредактировал ответ на «Очистка ПЦР» (вы можете проверить журнал). Я не был уверен, почему это было отформатировано как таковое.
Ах, сейчас. Обычно я провожу эти реакции в пробирках для ПЦР в термоциклере, потому что объем и так небольшой, и это очень удобно.
@MarchHo кавычки, потому что это не совсем стандартное название процедуры, я думаю. Этот термин популяризирует Qiagen :P Вы можете удалить его, если хотите.
Активны ли рестриктазы при -20°С?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v