Анализ фермента пектиназы

Я работаю над анализом фермента пектиназы. Я инкубировал 900 мкл субстрата в течение 10 минут на водяной бане, затем добавлял 2 мл реагента DNSA, затем добавлял 100 мкл экстракта фермента, наконец, я измерил оптическую плотность при 540 OD. Однако значения высокие. Как устранить неполадки с высокими пустыми значениями фермента в анализе пектиназы?

Итак, у вас есть проблема, что ваш бланк слишком высок?
Да, уровень фермента высокий
Можно ли исключить заражение?
Какие загрязнения? Насколько это возможно, производство ферментов осуществляется в незагрязненной среде.
Вы не делаете этот анализ в вашей руке, не так ли? А как насчет реакционных пробирок, кювет фотометра и т. д.?
Реакционные пробирки и кювета чистые
Разбавьте стандарты так, чтобы значения находились в линейном диапазоне и в пределах высокоточного диапазона спектрофотометра.
Я разбавил стандартный субстрат до 0,5% вес/объем, но холостые пробы ферментов по-прежнему имеют высокую ценность.
Что такое субстрат?
пектин (цитрусовый)
Бланк фермента мутный/мутный?
Да, есть изменение цвета на светло-коричневый
Если бланк мутный или окрашен, вы должны использовать его для калибровки/обнуления прибора (а не использовать воду или буфер). Это то, что вы делаете?
Я использую бланк реагента/субстрата для калибровки прибора

Ответы (1)

Итак, ваш бланк - это все, кроме фермента? То есть субстрат и ДНСА на 100 мкл воды? Если да, измерьте в качестве отрицательного контроля только субстрат и только ДНК. Если один из них также сильно поглощает свет, он может быть загрязнен, и следует заказать новый флакон. Если и то, и другое сильно поглощает, это может быть вода, которую вы используете, или спектрофотометр.

В качестве альтернативы вы можете попытаться измерить ход времени. Если со временем абсорбция бланка увеличивается, это свидетельствует о загрязнении, и вам может помочь изменение порядка реагентов. Если поглощение остается постоянным, вы не смотрите на загрязнение ферментами, то есть виновником является испорченная вода, нарушенная спецификация или даже неправильный протокол. (То есть изменение порядка или повторение не поможет.)

Анализ фермента пектиназы
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v