Я пытаюсь определить, как быстро моющие средства действуют на бактериальные клетки (лизис клеток). Я хотел бы сравнить некоторые моющие средства в разных концентрациях по бактериолитической активности. Меня не интересуют все метаболиты внутри клеток (белки, ДНК и т.д.). Многие публикации говорят о том, что зачастую используются более сложные решения. Моей первой мыслью было использовать для лизиса клеток простой приготовленный детергент в PBS или солевом растворе. Нужен ли мне комплексный раствор для лизиса клеток? Может ли кто-нибудь дать мне предложение? Заранее спасибо.
Какова цель лизиса клеток? «Сложные» решения, как вы говорите, включают в себя кучу ингредиентов. Детергент в значительной степени присутствует для растворения клеточных мембран (которые основаны на липидах) и позволяют экстрагировать белки или другие биохимические вещества изнутри клетки (и органеллы у эукариот). Есть также два типа моющих средств: ионные и анионные. Оба типа детергентов растворяют мембраны, но ионные детергенты, как правило, более агрессивны из-за сильного разрушения белковых структур.
Если важна биохимия белков, то следующими наиболее важными ингредиентами будут специфические ингибиторы протеаз: ферментов, расщепляющих белки. Их много, но некоторые примеры включают PMSF, EDTA, апротинин и т. д.
Иногда необходимо забуферить рН лизирующего раствора, чтобы отслеживать белковые комплексы, или сохранять белок естественным, или поддерживать ДНК в оптимальном диапазоне рН. Общие растворы для лизирующих буферов включают Tris-EDTA (TE), PBS и т. д. Этот выбор зависит от того, хотите ли вы использовать буфер и в каком диапазоне pH вы хотите хранить свой лизирующий раствор. Обычные буферы, такие как TE и PBS, рассчитаны на диапазон pH от 7 до 8. Существуют и другие буферы, которые используются для низких диапазонов pH (pH 4-6), но обычно они менее распространены.
Наконец, существуют способы лизиса клеток без использования какого-либо лизирующего буфера. Один из методов заключается в использовании ультразвука, при котором используются направленные импульсы высокочастотного звука для лизиса клеток путем их механического разрезания. Другой метод заключается в многократном замораживании-оттаивании клеток от -80°C до 4°C (обычно достаточно 3-х раз). Таким образом, лизис осуществляется за счет многократного образования кристаллов льда, которые разрезают клетки, высвобождая их содержимое.
Если у вас есть более конкретный вопрос, один из нас может помочь вам, но это дает общий обзор того, что связано с буферами для лизиса клеток.
Интересно, как вы планируете измерять лизис? Вы обнаружите, что многие методы лизиса кишечной палочки включают обработку лизоцимом и ЭДТА. Это делается для того, чтобы липополисахарид (внешняя мембрана) и пептидогликановые слои клеточной оболочки могли быть разрушены перед добавлением детергента (обычно SDS или Triton X-100) для растворения внутренней или цитоплазматической мембраны. Я подозреваю, что если вы добавите детергент к интактным клеткам, это не будет особенно эффективным, и любые затронутые клетки останутся денатурированными клетками, которые, например, по-прежнему будут вносить свой вклад в оптическую плотность.
Поскольку грамотрицательные бактерии обычно способны противостоять солям желчных кислот в тонком кишечнике, они могут быть весьма устойчивы к детергентам. Например, многие энтеробактерии могут расти в 5% SDS - см.:
Раджагопал С. и др . (2003) Восемь грамотрицательных бактерий в 10 000 раз более чувствительны к катионным детергентам, чем к анионным детергентам. Канада. Дж. Мик. 49:775-779