Вопрос: В частности, относительно ампициллина; При выращивании клеток в ТБ (потрясающий бульон) для экспрессии белка - когда мне ожидать исчезновения ампициллина из-за деградации b-лактамазами? (и сколько ампициллина добавляют помимо стандартных 100 мкг/мл)
Предыстория : я слышал слухи о том, что весь ампициллин (100 мкг/мл) разлагается в течение нескольких часов (2-3) из-за огромного количества b-лактамаз, выделяемых бактериями. Я также слышал, что некоторых это не беспокоит. , потому что 2-3 часов в любом случае достаточно, чтобы культура превзошла все, что вырастет после прекращения действия ампициллина. С другой стороны, некоторые люди также пишут, что добавляют еще ампициллин каждые 2-3 часа для поддержания селективности; тем не менее, я действительно не вижу смысла в сохранении селективности, пока у меня много белка, я все равно буду лизировать клетки и не использовать их ни для чего другого.
Мои условия выращивания: выращивать при 37 градусах до OD600=1 (занимает около 3 часов), затем индуцировать с помощью IPTG и выращивать при 25 градусах в течение 18 часов, все время 200 об/мин.
Конечный комментарий: я знаю, что обычно вы можете перейти на более дорогой карбенициллин, который разлагается медленнее, но мне больше интересно узнать, «насколько плох» ампициллин на самом деле для моих общих знаний (и я все равно буду продолжать его использовать). Также: Любые общие мысли или ссылки на литературу по этой теме, особенно для ампициллина, приветствуются.
довольно интересный вопрос. Давление отбора очень важно для любого типа работы. И действительно, амплицилин будет разлагаться в среде из-за секреции бета-лактумазы. Это ограничение, с которым мы должны столкнуться, хотя есть способы его обойти.
Например, при клонировании на чашке иногда можно заметить «меньшие» колонии, растущие вокруг центральной большой. Это связано с бета-лактумазами. Они не проблема, если вы собираетесь взять центральную колонию и поместить ее на свежую среду с новым амплицилином. Они просто вымрут. Без вреда.
В жидкой культуре хорошо не «перенасыщать культуру». Обычно не допускайте превышения OD600 = 1. Кроме того, не используйте старые запасы, так как это вызывает проблемы с выбором, и используйте более высокие концентрации ампициллина, если у вас все еще возникают проблемы с выбором!
Вообще говоря, 100 мкг/мл являются стандартными для большинства отборов при клонировании и должны быть достаточными для того, что вы делаете. Кажется, что ваш протокол должен нормально работать для выделения белка.
Последние замечания - это проблема, о которой не думает большинство микробиологов. Ампициллин имеет свои пределы!
https://www.addgene.org/mol-bio-reference/antibiotics/
https://bitesizebio.com/10188/whats-the-problem-with-ampicillin-selection/
ЛюбопытныйДерево
ЛюбопытныйДерево