Мне нужно выделить большую плазмиду из дрожжей и трансформировать ее в кишечную палочку. После трансформации я часто не получаю колоний. Одной из причин этого является то, что мини-подготовка дрожжей не сработала или концентрация ДНК слишком мала. Я пробовал два разных протокола изоляции:
Zymoprep I набор для приготовления дрожжевой плазмиды
Из документа: «на основе старого метода щелочного лизиса E. coli с добавлением нашей зимолиазы в первый раствор».
Протокол выделения фенол-хлороформа YAC
используется Дэном Гибсоном и др. al] за их огромные конструкции (>100kb)
В конце они используют дорогую колонку Qiagen с большой конструкцией, чтобы очистить и визуализировать дрожжевой экстракт на геле, но я пропускаю этот шаг, потому что колонка Qiagen стоит 40 долларов за клон дрожжей, что не масштабируется, если мы делаем много из эти.
Как я могу устранить неполадки и оптимизировать вышеупомянутые протоколы? Существуют ли какие-либо другие протоколы, более подходящие для большой плазмиды и не использующие слишком дорогие материалы?
Надежный протокол экстракции ДНК дрожжей, который я использовал, был в целом похож на протоколы, которые вы цитируете, но включал осаждение этанолом до и после экстракции P:C. Единственным дорогим материалом было время. Общая схема была такой:
Вы, наверное, знаете, что легенда об осаждении этанолом состоит в том, что выход тем лучше, чем дольше и холоднее вы проводите осаждение этанолом. Я только несколько раз проводил реакции с обратной транскриптазой, но приготовленная мной матричная ДНК провела ночь в этаноле при -80°C, чтобы максимизировать выход. Еще один момент, который нужно перепроверить, это то, что ваши дрожжевые культуры достаточно плотные перед началом работы.
Я успешно использовал набор Zymoprep, но только для небольших плазмид в экспериментах с двумя гибридами. Итак, их ферментная/буферная система для лизиса клеток работает хорошо, но я предполагаю, что ваша 42-килобайтная плазмида выпадает в осадок вместе с геномной ДНК.
Стандартные миди-колонки Qiagen способны фиксировать большие конструкции. Это творило чудеса для меня, когда я очищал большие BACmids от E. coli - и снижал стоимость до 10 долларов за образец (требуется дополнительный буфер, но это незначительные расходы). Возможно, стоит попробовать протоколы ДНК дрожжей Qiagen для миди-набора и посмотреть, сможете ли вы выделить свою большую плазмиду?
Гергана Вандова
ямад