Как были выделены первые гены из геномных библиотек или библиотек кДНК, не зная еще зонда для гибридизации?

Нижеследующее основано на главе о клонировании ДНК в 10-м издании книги «Биохимия нуклеиновых кислот» (RLP Adams et al. ), опубликованной Chapman & Hall в 1986 году. был опубликован в 1992 году и имел более современную обработку.) Извините за то, что его будет трудно найти. Он должен быть доступен в некоторых университетских библиотеках и через системы межбиблиотечного абонемента в некоторых странах. Раздел A.7.3 дает представление о методологии, использовавшейся в то время.

Свойства белков, которые можно использовать в качестве основы стратегии клонирования

При попытке клонировать ДНК определенного белка, для которого не существовало ранее существовавших клонов, которые можно было бы использовать в качестве гибридизационных зондов, нужно было учитывать свойства белка, который можно было бы использовать. К ним могут относиться:

• Последовательность аминокислот
• Антитела к белку
• Биологическая активность
• Особые физические свойства, такие как размер

(Очевидно, что если у человека не было такой «ручки» для белка, он не был в состоянии попытаться клонировать его кДНК или ген.)

Три общих подхода

Казалось, что существует три основных подхода:

• Нет выражения
• Косвенное выражение
• Прямое выражение

Подход, который можно было бы выбрать, также зависел от того, особенно ли много белка в конкретной ткани, когда можно было бы ожидать, что менее сложные и более трудоемкие подходы будут иметь шансы на успех.

Еще один момент, который следует подчеркнуть, заключается в том, что, по крайней мере, с эукариотами, сначала нужно искать клон кДНК, и только после этого пытаться использовать геномный клон для использования в качестве зонда для гибридизации.

1. Подходы «без выражения»

В подходах без экспрессии для идентификации клонированной ДНК полагались на аминокислотную последовательность. Один из таких подходов заключался в использовании гибридизационных зондов против участков аминокислот, кодоны которых имели ограниченную избыточность (Met и Trp имеют один кодон, а некоторые другие аминокислоты только два), используя условия гибридизации с низкой жесткостью. Это требовало удачи. В качестве альтернативы можно секвенировать случайные клоны и надеяться найти тот, который коррелирует с аминокислотной последовательностью. В то время секвенирование ДНК было медленным и трудоемким, так что это было применимо только к белкам, которых было относительно много в ткани, из которой была подготовлена ​​​​библиотека.

2. Подходы прямого выражения

Прямая экспрессия обычно предполагает использование бактериального вектора экспрессии, который обеспечивает слияние бактериального белка с частью эукариотического белка. (Статистически только один из шести клонов будет иметь правильную рамку считывания в слитом белке). Этот подход был предпочтительным, если у человека было антитело, для которого не требовался полный белок.

3. Подходы косвенного выражения

Под непрямой экспрессией подразумевают использование иммобилизованной клонированной кДНК для отбора соответствующих мРНК («гибридная селекция»), которые могут экспрессироваться в бесклеточной системе. Это было уместно, если отличительная характеристика требовала полноразмерного белка, как в случае биологической активности или размера.

Что касается гена инсулина, следующая статья, насколько я могу судить, является первой, в которой он был выделен:

Ульрих А., Шайн Дж., Чиргвин Дж., Пикте Р., Тишер Э., Раттер В.Дж., Гудман Х.М. 1977. Гены крысиного инсулина: конструирование плазмид, содержащих кодирующие последовательности. Наука 196:1313-1319.

Они воспользовались тем фактом, что инсулин вырабатывается β-клетками поджелудочной железы и, таким образом, обогащен мРНК инсулина. После выделения и обратной транскрипции поли(А)РНК ожидается, что основная полоса, наблюдаемая при электрофорезе полученной кДНК, будет принадлежать гену инсулина:

Казалось вероятным, что [основные] фрагменты были получены из кДНК инсулина из-за их значимости в препарате тотальной кДНК. Поэтому эти фрагменты, а также полные препараты кДНК использовали в экспериментах по клонированию.

Таким образом, они клонировали эту кДНК, секвенировали ее и обнаружили, что она содержит всю последовательность, кодирующую проинсулин:

Поскольку мРНК содержит терминальную поли(А)-последовательность, [клонированная] цепь ДНК, содержащая 3'-концевой поли(дА), имеет тот же смысл. Эта цепь определяет аминокислотную последовательность, которая точно соответствует всей кодирующей области крысиного проинсулина I и 13 из 23 аминокислот препептидной последовательности.

После определения этой последовательности и из-за ее высокой степени консервативности гомологичный ген человека можно было бы выделить путем гибридизации с кДНК инсулина крысы:

Белл Г.И., Суэйн В.Ф., Пикте Р., Корделл Б., Гудман Х.М., Раттер В.Дж. 1979. Нуклеотидная последовательность клона кДНК, кодирующего препроинсулин человека. Природа 282:525-527.