Я провожу реакции ПЦР с различными наборами вырожденных праймеров и хочу знать, что должно войти в мастер-микс.
Мой обычный мастер-микс:
На льду я добавляю свои прямые и обратные праймеры в соответствующие пробирки для ПЦР, добавляю мастер-микс в каждую пробирку для ПЦР, затем прямо перед помещением их в термоциклер я добавляю taq и перемешиваю.
Это правильный способ сделать это? Я получаю продукт, но думаю, что могу улучшить его, изменив то, что добавляю в мастер-микс. Например, не лучше ли добавить taq вместо кДНК в мастер-микс, а затем добавить кДНК до начала ПЦР? Можно ли одновременно добавлять кДНК и taq в мастер-микс?
Я всегда добавляю Taq в мастермикс. Во-первых, это упрощает работу и позволяет избежать этапов пипетирования, которые могут привести к загрязнению и о которых также можно забыть. Тогда фермент очень стабилен и без проблем переносит даже комнатную температуру. Так как мы собираемся нагреть эти 30-40 до 95°С, то это явно не проблематично. Поскольку реакционная смесь охлаждается, реакция не начнется. А даже если и будет, то особого усиления из-за низкой температуры не будет.
Я обычно добавляю в мастермикс все, что одинаково для всех реакций (это может включать и ДНК). Если я использую более одной ДНК, я делю мастермикс пополам. Таким образом, вы не будете делать различные ошибки пипетки для шаблона, что особенно важно для ПЦР в реальном времени. Обычно я немного разбавляю праймеры, чтобы можно было пипетировать большие объемы (просто использую часть воды, используемой для балансировки реакции ПЦР). Вы также можете предварительно смешать пары праймеров, если хотите, я никогда не видел проблем с этим.