Есть ли надежный источник хранения и стабильности таких восстановителей, как ДТТ?

Восстановители на основе тиолов

Нестабильность восстановителей на основе тиолов в растворе связана с их склонностью к образованию дисульфидных связей в результате следующей полуреакции:

$$\ce{2RSH -> RSSR + 2H+ + 2e-}$$

Понятно, что для образования дисульфидов необходимы:

• Депротонирование тиолов с образованием тиолатов (RS- ⁾ .
• Акцептор электронов.

Следовательно, растворы восстановителей на основе тиолов будут наиболее стабильными, когда:

• рН буферизован до преобладания тиоловой формы. РКа тиола в β-меркаптоэтаноле составляет 9,5, а в дитиотреитоле — 9,2 и 10,1 ( Whitesides et al., 1977 ). Буферизация рН ниже этого должна повысить стабильность.
• Акцепторы электронов удалены. В водном растворе акцептором электронов является молекулярный кислород. Дегазация буфера и хранение растворов в атмосфере инертного газа, такого как аргон, должны повысить стабильность.
• Катализаторы реакции удаляются. Катионы двухвалентных металлов, особенно меди (II) (Cu ²⁺ ), катализируют кислородзависимое образование дисульфидов даже в следовых количествах ( Smith et al., 1994 ). Следовательно, такие хелаторы, как ЭДТА, должны повышать стабильность.
• Температура низкая. Как и в большинстве химических реакций, скорость увеличивается с температурой.

Стабильность восстановителей на основе тиолов β-меркаптоэтанола (β-ME), дитиотреитола (DTT) и глутатиона (GSH) определяли в растворе в зависимости от pH при 20°C ( Stevens et al., 1983 ):

...и температура при pH 8,5:

...а также в присутствии меди (II) и ЭДТА при рН 8,5 и 20°С:

Ниже приведены табличные необработанные данные (это фактические данные из бумаги, которую я использовал для создания приведенных выше графиков, но обратите внимание, что мне было трудно построить «> 100»):

                               Half-life (h)        
pH    Temp (°C)    Additive    β-ME    DTT    GSH    
6.5   20           -           >100    40     16
7.5   20           -           10      10     9
8.5   20           -           4.0     1.4    1.3
8.5   0            -           21      11     8
8.5   40           -           1.0     0.2    0.2
8.5   20           Cu(II)      0.6     0.6    1.2
8.5   20           EDTA        >100    4      70

Как и ожидалось, стабильность снижалась при повышении рН и температуры, а также при добавлении меди. Стабильность увеличилась при добавлении ЭДТА.

---

Восстанавливающие агенты не на основе тиолов

Han and Han (1994) изучали влияние pH и состава буфера на стабильность раствора трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP). Хотя это не восстановитель на основе тиола, он все же подвержен окислению. Однако он достаточно стабилен в растворе:

pH    Solute/Buffer     % TCEP Oxidized After 3 Weeks
7.5   Tris-HCl          18.7 ± 0.6
8.5   Tris-HCl          16.8 ± 0.5
9.5   Tris-HCl          14.5 ± 0.5
8.2   borate             6.6 ± 0.2
10.2  borate             5.3 ± 0.1
6.8   HEPES             14.8 ± 0.4
8.2   HEPES             13.6 ± 0.3
9.7   CAPS               9.8 ± 0.3
11.1  CAPS               4.3 ± 0.1

Стабильность увеличивалась с увеличением рН, хотя эффект был невелик. Интересно, что состав буфера в большей степени влиял на стабильность, что особенно заметно в случае фосфата:

        % TCEP Oxidized After 72 Hours
 pH     0.15 M phosphate    0.35 M phosphate
 6.0    not determined      11.2 ± 0.3
 6.8     8.1 ± 0.4          56.8 ± 2.3
 7.0    23.5 ± 0.9           100
 7.2    33.4 ± 1.0           100
 7.4    56.5 ± 1.4           100
 7.6    56.8 ± 2.1           100
 7.8    48.9 ± 2.5           100
 8.0    36.6 ± 1.7           100
10.6    not determined      11.7 ± 0.5
11.6    not determined       9.1 ± 0.4

---

использованная литература

Хан JC, Хан GY. 1994. Процедура количественного определения трис(2-карбоксиэтил)фосфина, восстановителя без запаха, более стабильного и эффективного, чем дитиотреитол. Анальный биохим 220(1):5-10.

Смит Р.К., Рид В.Д., Хилл В.Е. 1994. Окисление тиолов медью (II). Фосфор Сера Кремний Relat Elem 90(1-4):147-154.

Стивенс Р., Стивенс Л., Прайс Н.С. 1983. Стабильность различных тиоловых соединений, используемых при очистке белков. Биохимическое образование 11 (2): 70.

Whitesides GM, Lilburn JE, Szajewski RP. 1977. Скорости реакций тиол-дисульфидного обмена между моно- и дитиолами и реактивом Эллмана. J Org Chem 42(2):332-338.