Клонирование двух флуоресцентных белков с разными промоторами в одной плазмиде?

Я хочу клонировать два флуоресцентных белка, управляемых разными промоторами, в плазмиде, которая будет использоваться для трансформации B. subtilis в локусе amyE. Для этого я хочу использовать плазмиду pSG1729 (Lewis and Marston, 1999), поскольку эту плазмиду можно использовать для гомологичной рекомбинации в этом конкретном локусе.

Теперь проблема в том, что по нескольким причинам (т. е. расположение сайтов рестрикции, сохранение гена устойчивости к spc и удаление текущего гена GFP), если я хочу клонировать два гена в эту плазмиду, они будут очень близки к друг другу (~10 б.п.). Будет ли это проблемой с технической или биологической точки зрения после трансформации? Я не думаю, что возможное прочтение будет плохим, так как я хочу, чтобы один из флуоресцентных белков (pHluorin) экспрессировался непрерывно. Может быть, есть вариант клонировать два гена в противоположных направлениях?

Это текущий генотип плазмиды:

Ori amyE5' currentGFP Spc amyE3' bla
вы можете использовать двунаправленный промоутер, вы можете расширить спейсер до ~ 100 п.н., просто используйте спейсер 10 п.н. в тандеме или лучше, с некоторой перетасовкой..
Проставка - хорошая идея, можно поподробнее о перетасовке?
просто используйте аналогичную последовательность, но не точно такую ​​же последовательность.. вы можете перемещать некоторые базы здесь и там.. хотя это не очень важно, это уменьшит повторения..

Ответы (1)

Если вы хотите выразить их в опероне, убедитесь, что у вас есть RBS на 5'-конце каждой кодирующей последовательности. Если вы разместите один 10bp ниже по течению без RBS, он будет транскрибирован, но не переведен... Если вам нужна дополнительная помощь, вставьте код ДНК каждого в качестве комментария.

Клонирование двух флуоресцентных белков с разными промоторами в одной плазмиде?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v