Как размер вставки влияет на скорость гомологичной рекомбинации в дрожжах?

При выполнении генетического нокаута в дрожжах с использованием гомологичной рекомбинации для замены последовательности гена-мишени через векторную ДНК область между фланкирующими областями в векторе должна быть той же длины, что и сайт рекомбинации в гене клетки-хозяина?

Если я правильно понимаю, я думаю, что вопрос Аделины состоит в том, должна ли ДНК между фланкирующими областями (т. е. интегрируемой вставкой) быть той же длины, что и нокаутируемый ген. Ответ - нет.

Ответы (2)

Как указывает Аандреев, чем больше размер вставки по отношению к флангам, тем ниже будет скорость рекомбинации. Это связано с тем, что донорская ДНК по существу становится негомологичной. См. рисунки ниже:

               введите описание изображения здесь

Рисунок 1: Влияние размера вставки на эффективность рекомбинации. Кунг и др. (2013) Appl Environ Microbiol. март 79(5):1712-7

         введите описание изображения здесь

Рисунок 2: Влияние размера фланга на эффективность рекомбинации. Кунг и др. (2013) Appl Environ Microbiol. март 79(5):1712-7

Тем не менее, вы упомянули, что хотите делать нокауты генов. В этом случае вам просто нужно сделать небольшую мутацию (например, ввести преждевременный стоп-кодон).

Использование инструментов редактирования генома, таких как Crispr-Cas, ZFN и TALEN, увеличивает скорость трансгенеза за счет введения двухцепочечного разрыва ДНК.

Их также можно использовать для создания нокаутов, когда NHEJ доминирует над HR в качестве механизма репарации ДНК. NHEJ подвержен ошибкам и может вызвать вставки, которые могут нарушить функцию гена.

Впечатляющий. Хорошо проработанная работа. +1
первая цифра очень красивая. Кроме того, я буду использовать их все, чтобы спорить в лаборатории позже.

На мой взгляд, существует прямая связь между вероятностью рекомбинации и размером вставки. Меньшие вставки с большими боковыми сторонами легче встраиваются. Это я понял из обзора исследований, основанных на системе Cas9/CRISPR. То же самое должно означать HR-мутагенез у дрожжей.

Итак, краткий ответ будет таким: более короткие вставки более эффективны. Однако я не смог найти никаких исследований связи между эффективностью рекомбинации и использованием вставок меньшего размера, чем целевая, или связи между размерами мишени и вставки. Систему Cas9/CRISPR использовали для вставки сайта loxP (34 нуклеотида) вместо ~10 п.н. в клетках ES мышей. Люди обычно пытаются вставить GFP или что-то похожее по размеру вместо более коротких геномных последовательностей.

Как размер вставки влияет на скорость гомологичной рекомбинации в дрожжах?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v