Какие инструменты могут помочь мне определить, взаимодействует ли растительный гомологичный белок с нкРНК таким же образом?

Первый пост здесь, так что простите меня, если я нарушу какие-либо правила этикета или форматирования.

Допустим, у меня есть белок человека. Когда он взаимодействует с нкРНК, обнаруженной у людей, он делает то, что меня очень интересует. Я вижу очень гомологичный (~ 85% идентичность AA) белок в растениях, и он широко консервативен. Я заинтересован в выявлении такой же активности этого белка в растениях. Единственная проблема заключается в том, что нет нативной нкРНК растительного происхождения, которая взаимодействовала бы с интересующим меня белком таким же образом. Итак, у меня возникла идея:

Что, если я представлю растениям расшифровку, которая решает эту проблему? Если растительная версия этого белка будет таким же образом взаимодействовать с этой (введенной) РНК, это будет действительно круто. Я хотел бы проверить эту гипотезу с некоторыми синтезированными конструкциями. Но прежде чем я выложу тысячи долларов на несколько конструкций, я хотел бы изучить любые прогностические или аналитические инструменты, чтобы усилить аргументы. Я знаю, что шансы против меня.

Спасибо!

Я не могу придумать никаких предиктивных инструментов, но я думаю, что вы должны сначала максимально упростить систему. Вместо того, чтобы пытаться экспрессировать нкРНК в растении, получите очищенный растительный белок и очищенную нкРНК, возможно, путем транскрипции in vitro. Смешайте их вместе и посмотрите, сможете ли вы использовать соосаждение, сшивание или что-то еще, чтобы найти связывание. Флуоресцентная анизотропия может быть крутой, если у вас есть флуореметр с поляризаторами, вы можете пометить РНК флуорофором, а затем измерить скорость акробатики, как только она свяжет белок, акробатика должна замедлиться. Используйте белок человека в качестве контроля.

Ответы (1)

Последовательность нкРНК человека может связываться с растительным белком в растительных клетках, ну и что с того? Вы можете сказать, что растительный белок работает как РНК-связывающий белок, но не более того. Другая проблема заключается в том, что растительный белок может не распознавать ту же последовательность РНК, что и человеческий белок.

Существует несколько способов найти РНК-партнеров РНК-связывающих белков.

СЕЛЕКС

Этот метод используется для поиска консенсусных последовательностей, которые ваш белок распознает in vitro. Как только вы найдете консенсусные последовательности, вы можете искать нкРНК растения.

КЛИП

Это похоже на анализ чипа. Вы можете найти настоящие мишени для ваших РНК-связывающих белков.

В моем экспериментальном плане я планирую использовать стенограмму репортера. Я смогу сказать больше, чем «это РНК-связывающий белок». Меня больше всего беспокоит именно то, что «растительный белок может не распознавать ту же последовательность РНК, что и человеческий белок», если вообще распознает. SELEX и CHIP, скорее всего, помогут мне в моей задаче. Спасибо вам за ваши предложения.
Я был бы осторожен, используя SELEX, чтобы найти эндогенные РНК, которые связывают белок, он, вероятно, найдет аптамер РНК, который хорошо связывает белок, но нет гарантии, что полученная РНК действительно будет связываться соответствующим образом или просто будет новой. последовательность, которая хорошо связывается. Способность заставить РНК связываться практически с чем угодно — вот почему SELEX так полезен.
Какие инструменты могут помочь мне определить, взаимодействует ли растительный гомологичный белок с нкРНК таким же образом?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v