Как можно биологически подтвердить трехстороннее взаимодействие генов, определяемое компьютером? Какие анализы или тесты необходимо провести с использованием клеточных/тканевых моделей и/или моделей на мышах, чтобы доказать, что три гена действительно могут иметь совместный эффект?
Скажем, легче идентифицировать и подтвердить взаимодействие генов, которые включают факторы транскрипции, такие как FOXM1. Рассмотрим трехстороннее взаимодействие генов при раке молочной железы — FOXM1-BUB1-CHEK1 — которое можно проверить на прямое взаимодействие с помощью вестерн-блоттинга и репортерных анализов. Но такие взаимодействия могут быть интересными, а могут и не быть, учитывая тот факт, что факторы транскрипции могут влиять на уровни экспрессии других генов. Большинство вычислительных исследований сосредоточено на выявлении взаимодействий генов на основе коэкспрессии или совместного появления. Существует литература по компьютерному выявлению отношений И/ИЛИ между взаимодействующими генами. У меня нет конкретного примера, но, ради аргумента, если мы подозреваем, что три гена взаимодействуют по принципу И, как мы биологически подтверждаем этот вывод? Я'
Спасибо
Держитесь, этот ответ будет расти со временем.
Мне пришло в голову, что мы могли бы написать небольшую книгу (или очень длинную обзорную статью), чтобы охватить как глубину, так и широту вашего вопроса (вопросов).
Во-первых, нам нужно определить и/или уточнить некоторые термины. Термин взаимодействиевероятно, означает разные вещи для разных авторов в разное время. На самом деле, один автор может использовать этот термин для обозначения разных вещей в разное время. Поэтому я хотел бы предложить провести некоторые различия. Например, я бы провел различие между генетическим взаимодействием между двумя генами (которое обычно обнаруживается в одном из модельных организмов с помощью генетического теста между двумя аллелями с потерей функции) и взаимодействием белок-белок (иногда называемым PPI) между двумя белками, кодируемыми теми же двумя генами. ИПП выявляли классическим методом совместной седиментации в градиенте плотности сахарозы, ко-иммунопреципитации (ко-IP) или аффинной хроматографии. Совсем недавно ИПП были обнаружены с помощью масс-спектрометрии (МС) (иногда в сочетании с аффинной хроматографией). ИЦП были выведены с использованием прокси-анализов,
PPI также можно обнаружить с помощью анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR), и вполне могут быть и другие.
Итак, когда вы говорите о взаимодействии генов, что именно вы имеете в виду?
Я постараюсь охватить как можно больше сценариев:
Взаимодействие генов (= коэкспрессия):
это, вероятно, легче всего проверить (например, с помощью вестерн-блоттинга, как вы упомянули), но сложнее всего интерпретировать. Без дальнейшего анализа функций генов вы не представляете, какой эффект может иметь их совместная активность. Если гены являются метаболическими ферментами или частью сигнального каскада, было бы неплохо проверить их отдельные роли в этих путях, а также проверить потенциальные синергетические эффекты. То же самое в принципе верно и для факторов транскрипции, но в этом случае «пути» часто не совсем понятны, вместо этого ищите:
Взаимодействие генов (= на одних и тех же мишенях):
В случае факторов транскрипции (а также, например, киназ/фосфатаз), которые коэкспрессируются, вполне разумно, что они также воздействуют на одни и те же мишени. Здесь вам нужно снова сравнить как отдельные эффекты (список генов, регулируемых вверх/вниз), так и синергетические эффекты (например, ген A препятствует нормальной работе гена B, ген C многократно увеличивает функцию гена B). Для анализа фактора транскрипции обычно следует анализировать экспрессию на уровне мРНК (посредством количественной ПЦР), поскольку уровень белка вводит (по крайней мере) еще один уровень регуляции.
Взаимодействия белков:
хороший способ доказать это экспериментально — использовать эксперименты co-IP (иммунопреципитация): вы используете антитело для удержания определенного белка и всех его (прямых) партнеров по связыванию. Затем вы показываете присутствие интересующих вас партнеров с помощью вестерн-блоттинга.
Одно предостережение для этого метода с трехсторонними взаимодействиями (или более высокого порядка) заключается в том, что - в зависимости от силы связывания белков - может быть очень сложно предотвратить совместную очистку чего-либо, кроме прямых партнеров по взаимодействию. Если вы хотите полностью доказать, что два белка взаимодействуют напрямую, эксперимент с дрожжами-2-гибридом (y2h) лучше подходит.
Другие охватили гораздо больше вопросов, но я добавлю пару подходов со стороны спектроскопии, так как недавно изучал их.
Биолюминесцентный резонансный перенос энергии (BRET) показывает, связываются ли белки in vivo: «BRET измеряет взаимодействие белков с использованием биолюминесцентного донора, слитого с интересующим белком, и флуоресцентного рецептора, слитого с его партнером по связыванию. Биолюминесцентный донор, обычно люцифераза, не не возбуждает флуорофор с помощью света, а передает резонансную энергию через диполь-дипольное взаимодействие. Для передачи резонансной энергии донор должен находиться в пределах 10 нм от рецептора и иметь правильную ориентацию, что делает этот метод полезным для измерения белков в непосредственной близости». (Из https://www.promega.com/resources/pubhub/features/bret-nanoluc-luciferase-and-protein-protein-interactions/ )
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) также показывает, связываются ли белки, но in vitro: «SPR чувствителен к изменениям показателя преломления в пределах примерно 150 нм от поверхности сенсора. Для изучения взаимодействия между двумя связывающими партнерами один партнер прикрепляется к поверхности. а другой проходит над поверхностью в непрерывном потоке раствора образца. Реакция SPR прямо пропорциональна изменению массовой концентрации вблизи поверхности. Системы Biacore можно использовать для изучения взаимодействий, в которых участвуют (в принципе) любые молекулы , от кандидатов в органические лекарства до белков, нуклеиновых кислот, гликопротеинов и даже вирусов и целых клеток». (Из справочника по анализу Biacore)
Это оба способа взглянуть на прямое взаимодействие, т.е. связывание. Функциональное взаимодействие — это совсем другая история.
мдперри
мдперри
кулфанк