Каковы плюсы и минусы сайт-направленного мутагенеза? Какие есть альтернативы?

Для лабораторного курса нам было поручено «удалить стоп-кодон, используя мутагенез, который находится в середине гена, чтобы экспрессировать полный ген. Затем он будет флуоресцировать».

Для этого мы рассматриваем сайт-направленный мутагенез, который может заменить стоп-кодон, однако является ли этот метод хорошим? Есть ли лучшие альтернативы SDM с использованием Quikchange? Каковы плюсы и минусы SDM, которые мы собираемся реализовать? Чтобы увидеть, удалось ли нам это, мы воспользуемся секвенированием ДНК и гель-электрофорезом.

Наш общий план выглядит так:

  1. Сбор плазмид из E. coli

  2. Гель-электрофорез плазмидной ДНК

  3. Выполните мутагенез с помощью Quikchange
  4. Трансформация при тепловом шоке
  5. ПЦР
  6. Используйте lac-промотор для получения генного белка

Одна из проблем, о которой я мог подумать, заключалась в том, как нам убедиться, что праймеры, несущие мутацию, не отжигаются друг с другом из-за их комплементарности?

Является ли расширение с перекрытием хорошей альтернативой? Есть ли какие-либо преимущества в использовании мутагенеза на основе транспозонов или точечного мутагенеза?

Благодарю вас!

Если бы это была моя лаборатория, мы бы просто заказали синтетический ген…
Зависит... речь идет о процессе или результате?

Ответы (2)

SDM будет идеальным инструментом для этой миссии, если только рассматриваемая плазмида не очень большая (20+ kb).

Когда вы выполнили SDM, переварите продукты с помощью dpnI, чтобы удалить исходные плазмиды, трансформируйте e.coli и используйте селективную среду, соответствующую вашей плазмиде. Только бактерии с плазмидой смогут выжить и сформировать колонии, выбрать несколько колоний и выполнить минипрепарат для каждой и секвенировать интересующую область. Вы можете использовать остальную часть минипрепарата с правильной плазмидой для трансформации и экспрессии. Так что пропустите шаг 5.

Хотя, как вы говорите, SDM является наиболее подходящим инструментом, применимы ли другие формы мутагенеза: основанный на транспозонах и точечный мутагенез для этой лаборатории, если мы захотим? И можете ли вы придумать какие-либо минусы использования SDM в этом случае?

Метод «Быстрая замена», вероятно, то, что вам нужно. Если вы беспокоитесь о самодополняемости (которой не должно быть слишком много), вы можете расположить праймеры так, чтобы они не были полностью комплементарными. только 10 п.н. должны перекрываться в месте мутации. Я включил небольшую диаграмму ниже, где X отмечает базу, которую вы хотите изменить.

Перекрывающиеся грунтовки

Одна альтернатива, которую я использую чаще, чем SDM, заключается в использовании ферментов рестрикции TypeIIS. Таким образом, вы можете мутировать столько баз, сколько захотите, за один раз! См. эту статью

Каковы плюсы и минусы сайт-направленного мутагенеза? Какие есть альтернативы?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v