Количественная оценка ДНК в биолаборатории средней школы

В некотором линейном диапазоне интенсивность окрашенных полос ДНК в геле прямо пропорциональна их массе. Построив стандартную кривую из полос известной массы, можно оценить массу неизвестных полос. Этот процесс называется денситометрией . Я кратко написал о его использовании для количественного определения белковых полос после SDS-PAGE в этом ответе , но я более подробно расскажу о том, как это делается с использованием следующего геля, окрашенного бромистым этидием:

Справа маркер молекулярной массы (BstEII расщепление ДНК λ) с полосами известной массы. Слева две полосы неизвестной массы (на самом деле плазмида с двойным разрезом).

Я использую бесплатную программу ImageJ для оценки интенсивности полос. У них есть учебник по измерению интенсивности полосы здесь . Вы также можете получить ImageJ, упакованный с Java (и кучей других вещей) в программном обеспечении Fiji .

Откройте изображение в ImageJ и с помощью Rectangleинструмента нарисуйте рамку вокруг маркера, затем выберите Analyze > Gels > Select First Lane(или нажмите Ctrl+1). Затем перетащите прямоугольник, чтобы окружить другую полосу, и выберите Analyze > Gels > Select Next Lane( Ctrl+2). Теперь выберите Analyze > Gels > Plot Lanes( Ctrl+3), чтобы построить график зависимости интенсивности изображения от положения на геле:

Площадь под каждым пиком (за вычетом фонового шума) представляет некоторую общую интенсивность для каждой полосы. Чтобы измерить эту площадь, используйте инструмент линии ( Straight), чтобы нарисовать границы на основании каждого пика:

Я сделал это несколько случайно здесь, но вы поняли идею. Теперь, используя инструмент «Палочка», щелкните внутри каждого пика, и ImageJ занесет в таблицу интегральную интенсивность каждого из них. Ниже показаны интенсивности маркерных полос (верхняя полоса — это полоса 1), а также их массы (которые известны):

          Mass (ng)    Intensity
Band 1    45           5319.891
Band 2    28           3816.234
Band 3    24           3256.406
Band 4    16           2298.749
Band 5    15           2074.749
Band 6    8            1084.991

Перенесите эти данные в Excel (или аналогичный) и постройте график зависимости интенсивности от массы. Полоса 1 выглядит так, как будто она находится за пределами линейного диапазона и занижает массу. На самом деле это было ожидаемо, поскольку, если вы внимательно посмотрите на полосу на изображении геля, вы увидите красные пиксели, указывающие на то, что она перенасыщена. Игнорируйте эту полосу и выполните линейную регрессию для остальных.

Регрессия дает уравнение$I = 134.74M + 53.988$с$R^2 = 0.9975$. Переставляя массу, имеем$M = \frac{I - 53.988}{134.74}$. Получите интенсивность неизвестных полос, как описано выше, и рассчитайте их массу с помощью предыдущего уравнения:

          Mass (ng)    Intensity
Band 1    27           3736.991
Band 2    15           2125.284