Расширение небольшого фрагмента ДНК

Есть ли способ удлинить небольшой фрагмент ДНК, скажем, в 150 п.н., сделав копии самого себя и присоединив каждую копию этого маленького фрагмента к концу этой последовательности в 150 п.н.?

Например, мне нужен фрагмент ДНК размером 1 т.п.н.+, состоящий из копий этой точной последовательности длиной 150 п.н.

Я провожу оптические тесты цепей ДНК, но проблема в том, что фрагменты ДНК, на которые я нацелен, слишком малы.

Однако, если фрагмент ДНК представляет собой просто повторяющуюся последовательность фрагмента ДНК, который я тестирую, тесты дадут те же результаты. По этой причине я пытаюсь создать длинную цепь ДНК всего из одного фрагмента ДНК, копируемого снова и снова.

Есть ли процедура, которой я могу следовать, чтобы выполнить это?

ну, вы можете использовать ПЦР в сочетании с какой-либо техникой лигирования...
Что именно ты пытаешься сделать? Если вы дадите более четкое объяснение своей экспериментальной установки и целей, мы сможем помочь вам в дальнейшем. Как бы то ни было, этот вопрос довольно расплывчатый.
@MattDMo Привет, в основном я провожу оптические тесты цепей ДНК, но проблема в том, что фрагменты ДНК, на которые я нацелен, слишком малы. Однако, если фрагмент ДНК представляет собой просто повторяющуюся последовательность фрагмента ДНК, который я тестирую, тесты дадут те же результаты. По этой причине я пытаюсь создать длинную цепочку ДНК всего из одного фрагмента ДНК, копируемого снова и снова.
Если оба конца удовлетворяют условию, при котором работает лигаза, вы просто лечите лигазой. Но вы получаете различную длину изделий лигирования. Вы можете вырезать из агарозы после электрофореза, если вы считаете, что выхода достаточно.
Не могли бы вы предоставить более подробную информацию? У вашего фрагмента тупые концы? Важен ли весь фрагмент или вы могли бы немного сократить его, если это необходимо?

Ответы (3)

Если вы пытаетесь получить 1 КБ повторяющихся последовательностей 150 нуклеотидов, то синтез в виде большого фрагмента может быть лучшей идеей. Это стоит ~ 150-300 $, но потенциально сэкономит массу времени. (см. gBlock от IDT в США)

ПЦР и лигирование с повторяющимися последовательностями — это головная боль. Это может быть правдой, что вы экономите деньги, но время и разочарование могут стоить дороже.

IDT не любит часто повторяющиеся последовательности, их становится трудно контролировать. Однако это зависит от вашей точной последовательности, поэтому поместите свою последовательность в их форму и посмотрите, вернется ли она с проблемой. Если нет, то это, вероятно, хороший дешевый способ сделать это. Не забудьте также получить праймеры для ПЦР для своей последовательности, чтобы вы могли сделать больше.

Учитывая стоимость синтеза ДНК, вы, вероятно, могли бы заказать две отдельные нити и отжечь их вместе. Спроектируйте два комплементарных рестрикционных фермента, выступающих концами последовательности. Например, на одном конце спроектируйте частичный сайт Bam HI , а на другом конце спроектируйте сайт Bgl II . Эти липкие концы отжигаются, но полученный продукт лигирования не может быть разрезан ни одним из ферментов.

Чередуя циклы лигирования, переваривания и лигирования, вы можете создавать конкатемеры исходного фрагмента. Затем вы можете очистить более длинные фрагменты и субклонировать их в соответствующим образом подготовленный вектор.

Вместо адаптеров поставить? (если ориентация не имеет значения)
Если ориентация не является проблемой, вы можете использовать затупляющий фермент или полимеразу с тупыми концами во время ПЦР (например, полимеразу Phusion), а затем перейти к лигированию тупых концов. Праймеры NB должны быть фосфорилированы!

Я предлагаю вам попробовать Recursive Directional Ligation . Он предназначен для того, чтобы делать именно то, к чему вы стремитесь, то есть «полимеризовать» короткие ДНК в более длинные. Вы можете найти протокол здесь http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/bm015630n

Расширение небольшого фрагмента ДНК
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v