Можно ли удалить одну цепь двухцепочечной ДНК in vivo?

Предположим, у нас есть последовательность двухцепочечной ДНК в клетках человека, скажем,

...ATCGATATCGATATTGCAGAGCATAGCTATAA...
...TAGCTATAGCTATAAGCTCTCGTATCGATATT...

Теперь я хочу расщепить одну прядь, такую, что у меня есть

...ATC..........................TAA...
...TAGCTATAGCTATAAGCTCTCGTATCGATATT...

Расстояние для меня не так важно, поэтому могу 20 бп убирать или 1000с. Следовательно, если мне понадобится какой-то PAM или около того, и он не находится рядом с целевым местом удаления, я просто перейду на 5', соответственно. 3' направлении, пока я не найду его и не расколю там, если я уверен, что тогда у меня есть целевой сайт с одной цепочкой.

Я был бы очень признателен, если бы вы могли помочь мне здесь!

Я не понимаю, в чем заключается ваш вопрос - почему вы пытаетесь удалить одну нить в естественных условиях ? Что такое PAM в этом контексте? Пожалуйста, отредактируйте свой вопрос, чтобы добавить дополнительные пояснения и детали.

Ответы (1)

В технологиях редактирования генов TALEN и ZFN используется пара одноцепочечных эндонуклеаз, которые в конечном итоге приводят к разрыву двухцепочечной цепи. Однако Cas9 в технологии CRISPR-Cas разрезает обе цепи ДНК (у некоторых видов бактерий есть ферменты Cas, которые разрезают только одну цепь [ссылка] ).

     введите описание изображения здесь

Изображение предоставлено: http://www.xenbase.org/other/static/CRISPr.jsp

Итак, если вы используете одну единицу пары, вы можете разрезать одну цепочку ДНК. Вы можете использовать другую нуклеазу, чтобы сделать надрез в другом месте той же нити. Это все равно не приведет к удалению последовательности ДНК между двумя участками разреза. Не существует доступной технологии, которая может сделать это в естественных условиях. Возможно (дикое предположение), вы можете использовать модифицированный олигонуклеотид (или даже синтезированную IVT РНК), который может связываться с этим участком последовательности и нарушать его взаимодействие с другой цепью ДНК. В любом случае участок одноцепочечной ДНК не был бы стабильным и быстро восстанавливался бы полимеразой.

Большое спасибо за Ваш ответ. Еще одна вещь, которая была бы достаточна для моего проекта, заключалась бы в том, что в определенном месте ДНК раскручивается in vivo (возможно, с помощью какого-то фермента CAS, такого как dCas9, хотя другие могут быть здесь лучше подходящими). Тогда одна из нитей может быть «скрыта» механизмом, но другая должна быть доступна для игры с ней. Возможно ли такое?
@tobias Возможности безграничны, но мы должны выбрать тот, который в принципе самый простой и простой в реализации.
Конечно :). Что бы вы предложили для этого?
@tobias Я не думаю, что такой белок еще создан. Это был бы исследовательский проект сам по себе, и вам пришлось бы провести много экспериментальных испытаний. Так что я не могу многого посоветовать по этому поводу - вы должны попробовать. То, что я сказал в ответе (предположение), было бы первым, что я попробовал бы, потому что это легко.
Большое спасибо за Ваш ответ. Что касается второго вопроса, где я пытаюсь получить большую цепочку одноцепочечной ДНК, могу ли я слить dCAS9 с геликазой, чтобы dCAS9 связывался специфичным для последовательности способом с двухцепочечной ДНК, открывал ДНК, а геликаза открывала ее, скажем, на несколько десятки бпс. Это реалистично?
@tobias Звучит хорошо, но, как я уже сказал, это может быть сам по себе исследовательский проект. Иногда даже самый совершенный дизайн на бумаге может не получиться в лаборатории (со мной так было трижды). Всегда есть некоторый риск при разработке нового инструмента. Это может или не может работать. Если есть желание, то можно попробовать. Более того, даже этап проектирования потребует много размышлений (как объединить белки, как будут взаимодействовать домены и т. д.).
Можно ли удалить одну цепь двухцепочечной ДНК in vivo?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v