Я не работаю в мокрой лаборатории и не знаю всех деталей техники нокдауна.
Мой вопрос:
как осуществляется нокдаун lncRNA?
Например, у вас есть днРНК, функционирующая в ядре . Как можно осуществить нокдаун с помощью iRNA, если интерференция происходит только в цитоплазме ?
Извините, если в моем вопросе есть заблуждение, связанное с биологией.
Нокдаун днРНК у млекопитающих не осуществляется с помощью РНКи. Вместо этого переносят антисмысловые олигонуклеотиды ДНК, которые связываются с РНК. Это запускает действие фермента РНКазы Н , который расщепляет дуплексы РНК-ДНК. Он разрушает lncRNA.
ОБНОВЛЕНИЕ: Для справки, я узнал об этом на семинаре, и это не очень хорошо задокументировано, но после некоторого поиска литературы я нашел эту статью, чтобы процитировать :
Хотя мы (рис. 3А) и другие (42, 49) использовали миРНК для нокдауна днРНК NEAT1 и хотя нокдаун строго ядерных РНК хорошо описан (53, 54), мы по-прежнему обеспокоены тем, что, поскольку NEAT1 в основном является ядерным РНК (55), она может быть не очень эффективно нацелена на механизм РНКи. Ядерные РНК, однако, умело нацеливаются с использованием комплементарных антисмысловых (AS) олигодезоксинуклеотидов, которые задействуют активность ядерной РНКазы H для деградации РНК (56). Следовательно, мы также использовали комплементарные олигодезоксинуклеотиды AS для нокдауна днРНК NEAT1 в клетках Jurkat, инфицированных ВИЧ-1 NL4-3 (рис. 4C, слева). Подход AS уменьшал NEAT1 (рис. 4C, слева) и увеличивал продукцию p24 ВИЧ-1 (рис. 4C, справа), обеспечивая результаты, согласующиеся с результатами siRNA-опосредованного нокдауна NEAT1 (рис. 4A и B).
Происходит ядерная РНК-интерференция. Проверьте эти статьи:
http://www.nature.com/nrg/journal/v14/n2/execsumm/nrg3355.html
http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2011/11/07/nar.gkr891.full
Также есть некоторые доказательства того , что Ago2 связывается с lncRNAs.
Тем не менее, вы можете использовать другие методы для нокдауна lncRNAs, например, для рибозимов.
Это противоречиво, но большинство групп в этой области пришли к выводу, что РНК-интерференция не работает в ядре, несмотря на присутствие Ago. Когда lncRNA подвергают KD с помощью RNAi, обычно показано, что они присутствуют как в ядре, так и в цитоплазме, и считается, что KD происходит в цитоплазме, а не в ядре. Конечно, как и всегда в биологии, возможно, что ядерная РНКи действительно встречается в некоторых типах клеток или при некоторых особых условиях. Олигонуклеотиды Gapmer, действующие через РНКазу H, обычно являются отличным способом KD ядерной днРНК, но я бы добавил, что вы должны быть готовы протестировать, скажем, 6 или более различных олигонуклеотидов, поскольку эффективность непредсказуема, и, в отличие от РНКи, нет больших общедоступные алгоритмы дизайна антисмысловых олигонуклеотидов.
смерть
дрозофила