Ожидается, что я буду отслеживать рост клеток, измеряя концентрацию клеток в инкубируемой культуре каждые 30 минут или около того. Итак, мои вопросы: почему мне нужно делать серийное разведение (при условии, что я это делаю)? Почему я не могу просто заполнить кювету инкубируемой культурой, равной объему кюветы, и измерять ее относительно бланка каждые 30 минут? И если мне нужно разбавить, до какой степени (1:100, 1:1000 и т. д.)? Это для культуры, наполненной кишечной палочкой.
Обычно не требуется серийное разведение культур E. coli для спектрофотометрических измерений, по крайней мере, в экспериментах, где важно значение оптической плотности.
Для большинства работ по экспрессии белков принято начинать индукцию при ОП 0,6, а для большинства химически компетентных клеток оптимальная ОП колеблется от 0,3 до 0,8 в зависимости от протокола компетентности. Ни в коем случае вам не нужно выполнять разведения, так как все они находятся в пределах линейного диапазона количества клеток: отношения OD.
Единственный раз, когда вам нужно разбавлять культуру, это когда вы хотите найти OD очень концентрированной культуры (например, после 24 часов инкубации с сильным встряхиванием).
Измерение оптической плотности микробной культуры в логарифмической фазе при фиксированной длине волны аппроксимирует закон Бера-Ламберта, где A = ecl. Эта зависимость не является линейной, так как абсорбция приближается к 1,0, поэтому при более высокой плотности клеток вы в конечном итоге недооцените плотность клеток в культуре. Точно так же закон не точен при абсорбции ниже ~ 0,05, поэтому 10-кратное разведение должно подойти. Со временем рост культуры замедлится.
Вы должны разбавлять (не обязательно серийно разбавлять), если:
Таким образом, нет никаких проблем с тем, что закон не выполняется при определенных пределах поглощения.
Таким образом, общее эмпирическое правило для разбавления клеток состоит в том, что суспензия не должна выглядеть очень мутной (вы должны видеть свой большой палец с другой стороны пробирки ;-)).
Это зависит от вашей цели, но вы можете посеять клетки в многолуночный планшет и позволить микропланшетному ридеру следить за ростом. Некоторые устройства для считывания микропланшетов могут инкубировать клетки при установленной вами температуре, встряхивать планшет и контролировать оптическую плотность.