Первоначальный дизайн для сборки Gibson

Я пытаюсь разработать учебник для сборки Gibson . Интересующий меня ген находится на плазмиде, и я хочу скопировать этот ген и поместить его в другую плазмиду.

Я не знаю, как разработать мои праймеры для ПЦР. Я знаю, что мне нужно 2 комплекта праймеров (всего 4).

  1. Обратный и прямой праймер для копирования моего гена из плазмиды, которая его содержит.
  2. Обратный и прямой праймер для копирования плазмиды.

Я также знаю, что мне нужно создать дополнительные области перекрытия между моим геном и плазмидой, в которую я хочу его поместить. Как мне это сделать?

Вот плазмида и ген. Я хочу поместить ген между префиксом и суффиксом биокирпича.

Вот какие праймеры мне нужны:

Для плазмиды, в которую я хочу поместить ген, мои праймеры должны быть

  • Вперед:ATTCGCGGCCGCTTCTAGAG
  • Обеспечить регресс:CTGACGCGGCCGCTACTAGTA

Праймеры для копирования гена и добавления перекрытия

  • Обеспечить регресс:ATCATTTCAAATTCGTCCATCTCTAGAAGCGGCCGCGAAT
  • Вперед:AATTAGAAAGAGATTATAATACTAGTAGCGGCCGCTGCA

вот это ген.

Вот плазмида, в которую я хочу ее вставить. Я использую гениальный, но думаю, что для этой цели отлично подходит слово.

ваш ген имеет длину 5 кб.. вы не можете собрать его с помощью 4 праймеров.. Кстати... зачем вам его собирать? можно сделать обычную ПЦР..проще
@WYSIWYG ген TyrRs составляет всего 1920 п.н. плазмиды в связанном файле.
@AlanBoyd .. для его сборки все равно потребуется более 4 праймеров .. Чтобы собрать фрагмент ~ 320 п.н., я использовал четыре 90-мера ..
Марко... Я думаю, что вы хотите сделать вложенную ПЦР... в сборке Гибсона вы собираете весь фрагмент ДНК, используя несколько небольших олигонуклеотидов...

Ответы (2)

Отказ от ответственности: я никогда не занимался сборкой Gibson, но вот мое теоретическое понимание того, как проектировать капсюли. Вам нужно четыре 40-мера, каждый из которых состоит из сегментов по 20 п.н., полученных из вектора и вставки и соответствующих соединениям, которые вы пытаетесь создать. На приведенной ниже диаграмме пунктирные линии представляют соединения между двумя сегментами по 20 п.н. каждого 40-мера.

введите описание изображения здесь

Вот хороший обзор особенностей конструкции капсюля при использовании сборки Gibson. http://j5.jbei.org/j5manual/pages/22.html

в нем говорится, что плазмиду можно линеаризовать, разрезая ее, поэтому вам потребуется всего 2 праймера для клонирования вставки. в чем преимущество клонирования вектора? Я предполагаю, что это экономит минипрепарат, но 2 олигопрепарата стоят больше, чем минипрепарат.
Недостатком разрезания вектора является то, что на стыке уже должен существовать сайт рестрикции. Это основное ограничение, которое Gibson преодолевает. Потенциальные недостатки использования ПЦР для амплификации остова: у вас могут возникнуть проблемы с запуском ПЦР (всегда потенциальная проблема), и существует минимальный риск внесения мутаций во время ПЦР (но phusion полимераза должна давать очень мало мутаций).
У большинства векторов есть удобные места разреза, но я вижу, что это удобно во многих отношениях, и было бы быстро заказать новые олигонуклеотиды для вектора. Я очень хочу попробовать это в лаборатории...
@MarkB, не могли бы вы отредактировать свой пост, чтобы обобщить часть содержания этой ссылки на случай, если ее не будет в будущем?
Эта ссылка помогает ответить на вопрос, но на Stack Exchange мы предпочитаем ответы , которые не зависят полностью от ссылки на другой веб-сайт.
Первоначальный дизайн для сборки Gibson
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v