Время жизни флуоресценции молекул, используемых в биологических приложениях, обычно находится в диапазоне от субнс до нескольких нс (скажем, 0,8-4). Наиболее прямые методы измерения продолжительности жизни обычно включают стробирование (либо явное, либо с помощью временных корреляций).
Но это ужасно расточительно, так как информация от тех фотонов, которые не пришли в выбранное время, отбрасывается. Если у вас есть хрупкий образец, вы можете уничтожить его до того, как закончите измерение; если у вас быстро меняющийся процесс, состояние может измениться до того, как вы закончите измерение.
Каков уровень техники непрерывного подсчета фотонов в видимом диапазоне (возможно, 450–600 нм) и находится ли он на уровне, при котором можно разумно измерять время каждого фотона, не снижая скорость счета значительно ниже самого времени жизни флуоресценции? Фотофизика допускает измерение времени жизни на частоте МГц (~100 фотонов с интервалом в 10 нс), но реально ли это делать?
Хотя для подсчета фотонов доступно множество вариантов (ФЭУ, APD, GaAsP), мне было трудно получить точное представление о скоростях и ограничениях различных реально доступных устройств или о физических ограничениях для определенного типа. схемы обнаружения. Например, страдают ли ФЭУ размытым временем считывания из-за распределения длин пробега электронов в каскаде? Делают ли тепловые эффекты бесполезными APD для устойчивого высокоскоростного считывания, даже если они достаточно малы, так что емкость не является серьезным препятствием для перезарядки? (Или емкость невероятно плоха для скоростей ГГц даже с очень маленькими, например, квадратными устройствами 100 мкм?)
Схема, используемая несколькими современными детекторами физики элементарных частиц, почти наверняка может работать (хотя обычно она включает в себя специальную высокоскоростную электронику, которая довольно дорога; возможно, небольшая система может обойтись только хорошей ПЛИС...).
Базовая схема заключается в непрерывной оцифровке выходных данных первичных детекторов (ФЭУ или чего-то еще) в циклический буфер из циклических буферов. Два экземпляра этой системы, с которыми я работал, использовали ширину АЦП -- , но в этом нет ничего особенного: вы можете довольно легко сократить время примерно до 1 нс и примерно должно быть возможно.
На уровне электроники первичный сигнал предварительно усиливается (при необходимости/желании часто достаточно усиления первичного детектора) и разделяется (как минимум) на триггер и цифровую электронику.
Цифровая электроника поддерживается круговые буферы образцы каждый. Каждый буфер также поддерживает указатели на начало и конец недавно записанных данных. В любой момент времени система работает на образце буфера ; образец написан и рабочий образец продвигается . В случае, если триггер не срабатывает, система может непрерывно перезаписывать «неинтересные» данные по мере их появления. циклически проходит весь диапазон.
Когда происходит триггер, система продвигает буфер так что самые последние буфер(ы) не будут перезаписаны.
Затем система сбора данных может считывать зафиксированные буферы по мере наличия времени и реконструировать «интересные» части сигнала. (Если вам нужно знать, как выглядят «неинтересные» части сигнала, вы всегда можете сгенерировать ложный триггер, чтобы зафиксировать «ничего»; это называется «минимальным смещением» или «случайным» триггером, и обычно он вам нужен . .)
Размер отдельных буферов выбирается таким образом, чтобы весь сигнал находился в одном фиксированном окне. Количество необходимых буферов зависит от ожидаемой скорости и задержки считывания. Вам нужна какая-то схема для работы с триггерами, чем настолько близко друг к другу, что «следующий» буфер все еще содержит устаревшие данные (лишь частично перезаписанные), и другие проблемы, которые, я уверен, вы можете увидеть сами, если задумаетесь.
Это не обязательно подсчитывает фотоны, это позволяет вам приблизительно реконструировать аналоговый сигнал от детектора с временной гранулярностью порядка ширины выборки. Таким образом, вы не всегда можете отличить, скажем, два зеленых фотона в близком совпадении от одного почти УФ-фотона, но этого часто бывает достаточно.
Я подозреваю, что внутри высокоскоростных осциллографов происходит нечто подобное.
По состоянию на февраль 2016 года существует два способа реального подсчета фотонов на частотах выше ГГц, которые являются доступными и технически обоснованными. Технологии продвинулись вперед, в отличие от хвастовства чрезмерными техническими характеристиками. Hamamatsu производит гибридную трубку R10467U-40 с QE 45% в видимом диапазоне и возможностью подсчета фотонов на частотах в несколько гигагерц. Это было достигнуто для LIDAR с использованием двойного YAG-лазера в NPS. Сигналы лидара представляют собой комбинацию экспоненциального затухания и соотношения 1/R^2, а гибридная трубка отлично подходит для ослабления сигналов. Это похоже на затухание флуоресценции, но более сложно из-за большого динамического диапазона и сильно меняющегося сигнала. У Hamamatsu есть еще одна трубка, которая также обеспечивает непрерывный подсчет в ГГц, но она не адаптирована для этого приложения.
На последней странице следующей веб-ссылки есть литература, в которой сравниваются сильные и слабые стороны различных детекторов в разделе «О подсчете фотонов». Производители, как правило, не указывают на недостатки тех или иных детекторов, но в этой статье, основанной на 40-летнем опыте.
http://www.photoncounting.net/
Недавно был разработан и протестирован новый цифровой выходной интерфейс к лампе Hybrid. Счетчик фотонов в ссылке может делать бины 250 пс, используя все четыре канала, или можно заплатить в 10 раз больше и получить немного лучшее разрешение бина. Два усилителя в линии позволяют считать фотоны на частоте 2 ГГц.
В отличие от электронных умножителей, гибридная лампа может восстанавливаться после сильного сигнала за наносекунду без хвоста затухания. Для точного измерения времени жизни флуоресценции лучше всего собирать большое количество фотонов, а не измерять время их прибытия с точностью до нескольких пикосекунд, а при подсчете фотонов на частоте 10 МГц это будет трудно сделать. Метод подсчета гигагерцовых фотонов представляет собой значительное улучшение по сравнению с методом ультрацентрифужного прерывателя света со скоростью вращения 20 000 об/мин, который я использовал для измерения субнаносекундного времени жизни с помощью ФЭУ в темные века.
Общая стоимость гигагерцовой системы при наличии цифрового осциллографа должна быть менее четырех тысяч долларов. Большинство компаний больше не публикуют свои цены на счетчики фотонов. Две компании, производящие сверхбыстрые системы:
http://www.fastcomtec.com/products/ultra-fast-photon-counters.html
а также
Эти счетчики Photon, как правило, дорогие - от 5000 до 15 000 евро. В отличной литературе Becker-hickl описываются измерения гибридной трубки и методы затухания флуоресценции.
В настоящее время доступны доступные цифровые логические микросхемы с временем нарастания 30 пикосекунд и частотой переключения более 10 ГГц. Пришло время обновить этот вопрос.
пользователь4552
Экхорн
Рекс Керр