Рецепт высокоточного (скоростного) буфера передачи

Кто-нибудь знает эффективную буферную смесь, которую можно использовать для западных передач с высоким током? Мы успешно используем предварительно смешанный буфер поставщика для переноса белка широкого диапазона размеров на мембраны PVDF при 1A/25V в течение 10 мин. Мы получаем отличные результаты с дорогим буфером поставщика.

Я не смог найти незапатентованный рецепт, который работает. Лучшие из них, которые у нас есть, удерживают 25 В, но затем имеют снижение проводимости (увеличение сопротивления), когда они начинаются с 1 А, но падают до 0,4 А к концу 10 минут. Буфер поставщика, похоже, выдерживает большой ток и обеспечивает лучшую передачу.

Я не знаю, будет ли полезно подробно перечислить все варианты, которые я пробовал, но они вращались вокруг модификации традиционного буфера Towbin плюс SDS, большего количества глицина/триса или MgCl2. Все это были различные предложения людей из отдела, но я не нашел много опубликованных доказательств наличия буфера в этих условиях.

Я понимаю, что 1 А (и нет, я не имею в виду 1 мА) — это большой ток, но система поставщика работает очень хорошо. Любые указатели на то, что я мог бы попробовать/добавить, будут оценены, даже если у вас нет разработанного протокола.

Изменить: информация из MSDS указывает на то, что в нем есть 3 реагента:

Listing of dangerous and non-hazardous components:
Proprietary Reagent K
10-20%
Proprietary Reagent EB II
5-10%
Proprietary Reagent S
1.0-2.5%
7732-18-5 water
50-100%
·
.....
Solvent content:
Organic solvents:
0.0 %
Water:
74.8 %
Solids content:
25.2 %

[Я не уверен, что эту информацию о паспорте безопасности следует размещать здесь, просто потому, что я ищу кого-то, кто уже использовал сильноточный буфер, для которого он знает состав, а не догадки о том, что у меня есть.]

Я не могу помочь вам в отношении мокрых буферов передачи. Если вы не возражаете против использования проприетарных систем, я настоятельно рекомендую систему iBlot (Invitrogen). Это сухой перенос, доступный с мембранами из нитроцеллюлозы или ПВДФ, полный перенос занимает около 7 минут. Это может показаться дорогим, но я уверен, что это сэкономит вам деньги в долгосрочной перспективе.
@leonardo Я считаю, что хотя Life Technologies (должна идти в ногу со слияниями) назвала бы iBlot «сухим переносом», это действительно похоже на полусухой перенос с очень хорошей настройкой предварительно упакованных ячеек. Я использовал их, и гели определенно казались более влажными, чем сухими. Я чувствую, что у Ликора, как у стороннего неигрока, был интересный анализ .
Да, Life Tech теперь является материнской компанией. ;) Анализ интересный, но из отчета я бы сделал вывод, что iBlot имеет такую ​​же эффективность, как влажный и полусухой методы переноса. Самым большим улучшением, которое я обнаружил, было большее разрешение и четкость полос по сравнению с SDS-акриламидными гелями, заливаемыми вручную.
@leonardo, хотя вы получаете такое же разрешение / резкость, используя сборные гели и стандартный метод мокрого переноса Towbin ...
@MattDMo Я, конечно, очень люблю классический перевод Towbin, но сейчас я нахожусь в месте с высокой пропускной способностью на западе. Я делаю около 4 гелей и 16 блотов в день с помощью высокоскоростных решений (и получаю хорошие данные), я просто надеялся найти способ снизить затраты.
@AtlLED - я понимаю, откуда вы, я просто пытался прояснить комментарий Леонардо о ясности. FWIW, раньше я запускал по крайней мере столько вестернов в день: я использовал сборные гели Invitrogen и выполнял влажный перенос при 100 В (постоянно) в течение 1 часа при 4°C. Одной из проблем, которые мы обнаружили с iBlot, была его эффективность переноса очень маленьких/больших белков — вы можете получить один или другой, но, как правило, не оба.
Я бы посмотрел как на лист MSDS, так и на патент. Они должны помочь вам идентифицировать компоненты, но не рецепт.
Уже сделал. Скрыт в пропиатрии. Даже дал огромные диапазоны в том, какими когда-либо были исторические соединения.
кто-нибудь видел эту статью? sciencedirect.com/science/article/pii/S0003269713003230 Я попробовал, и это работает!

Ответы (2)

Поэтому после большой работы по оптимизации я решил опубликовать то, что лучше всего подходит для меня. Этот рецепт буфера был способен успешно переносить EGFR и инсулин из одного и того же лизата и иметь четкую полосу для обоих (большой и малый белок соответственно). 10% гели SDS-PAGE переносили при 1А в течение 10 мин.

Буфер передачи сильного тока

  1. 48 мМ Трис
  2. 15 мМ HEPPS
  3. 1,0 мМ ЭДТА
  4. 1,3 мМ NaHSO3
  5. 1,3 мМ N,N-диметилформамид
  6. 25 мм ГЛИ-ГЛИ
  7. 20% метанол (об./об.)

Я надеюсь, что это может помочь кому-то еще, и хочу разместить Garic et al в качестве прекрасной отправной точки. Их публикация была сделана после того, как я задал вопрос, как указал @user4148.

Буфер SB существует уже довольно давно, и я определенно успешно использовал его раньше как для агарозных, так и для гелевых буферов PAGE в течение некоторого времени. Единственное, что вам нужно запускать гель в холодной комнате (высокое напряжение равно высокой температуре) и что вы должны оптимизировать время и условия, чтобы ваши образцы не стекали с геля.

Я использовал СБ. Во-первых, это не рабочий буфер, а не буфер передачи (или, по крайней мере, я никогда не слышал, чтобы он использовался в передаче), во-вторых, я считаю, что формулировка все еще какая-то широкая, нет?
Если вы посмотрите на рецепт рабочего буфера, он содержит SDS, тогда как буфер для переноса содержит метанол. Используя тот же базовый буфер, но добавляя другой реагент, я использовал его раньше. Тем не менее, вам, возможно, придется попробовать его с вашим конкретным рецептом и условиями работы, чтобы оптимизировать его.
Рецепт с буфером SB для вестерна mcdb.ucla.edu/Research/Banerjee/protocols/Western-Blotting.pdf
Дело было не в том, что я не мог найти рецепты SB, а в том, что я мог найти несколько. Я попробую связанный и посмотрю, как он справляется с оптимизацией. Я до сих пор не могу найти примеры SB в ситуациях с высоким током и низким напряжением (особенно для переноса белка). Тот, который вы связали, отмечает 25 В o / n, что противоположно тому, к чему я пытаюсь.
Я просто указываю, что его можно использовать и для буферов передачи. Но достаточно интересные люди, кажется, имеют смешанный опыт с ним. Я думаю, что в целом вы, вероятно, не хотите запускать быстрые передачи, если вам нужны очень точные или точные результаты, потому что это, как правило, компромисс, который вам нужно учитывать.
Ах, но есть загвоздка, я получаю как точные, так и точные результаты с буфером поставщика. Я сравнил это непосредственно с ночной медленной пересадкой танка.
Вероятно, потому, что они потратили много времени и денег на оптимизацию продукта. Многие проприетарные рецепты и протоколы не более или менее сложны, я думаю, они просто лучше оптимизированы...
Да, я не думаю, что буфер SB будет работать. Я попробовал несколько составов, и все они оказались намного хуже. Некоторые даже варились.
Рецепт высокоточного (скоростного) буфера передачи
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v