Вопрос довольно прост: влияет ли фиксация формальдегидом или метанолом при подготовке к иммуноцитохимии/иммунофлуоресцентному окрашиванию на рН лизосом?
Немного предыстории: я пытаюсь изучить внутриклеточный транспорт флуоресцентно-меченого лизосомального фермента. Клетки выращивают in vitro и обрабатывают меченым белком, который проникает в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза . Комплекс белок-рецептор нацелен на поздний путь эндосома-лизосома, где в конечном итоге кислый рН лизосомы заставляет их диссоциировать и рецептор рециркулировать, в то время как фермент остается и делает свое дело. Я пометил фермент двумя разными красителями — Alexa Fluor 488, который предположительно нечувствителен к pH от 4 до 10 , и pHrodo Red., который значительно увеличивает флуоресценцию при снижении pH. Alexa488 — самый яркий из красителей Alexa, и он широко используется во всех видах приложений. pHrodo не такой яркий (насколько я могу судить, было трудно найти сравнения), но его pH-зависимость помогает снизить эффект неспецифического внеклеточного связывания, и, похоже, он работает в моей системе до сих пор.
Так в чем проблема? Я разрабатываю анализ, который будет измерять способность определенных веществ блокировать поглощение этого фермента клеткой. Так как я буду измерять отсутствие сигнала, чем выше я смогу получить свободный сигнал, тем лучше. Как я уже сказал, pHrodo работает нормально, но могло быть и лучше. Проблема в том, что мой белок, помеченный Alexa, имеет чрезвычайно низкое отношение сигнал/шум, хотя я ожидал совершенно противоположного. Мне интересно, действительно ли в моей системе краситель Alexa несколько чувствителен к pH и не флуоресцирует, когда находится в кислой лизосоме. Я также столкнулся с несколькими другими проблемами, и хотя до того, как я начал выполнять визуализацию живых клеток, я начинаю играть с идеей сначала исправить клетки,
Отсюда мой вопрос: повлияет ли фиксация клеток 4% формальдегидом в PBS (стандартный протокол ICC/IF) на pH лизосом? Будет ли фиксация метанола делать то же самое? Любые другие предложения по увеличению сигнала?
На мой взгляд, фиксация клеток не должна изменять рН. Однако небуферный формалин будет окисляться и снижать pH, но использование PBS должно обеспечивать буфер около pH 7. Возможно, фиксация глутаровым альдегидом также будет вариантом, если другие не работают ...
Я нашел этот веб-сайт leica очень полезным, возможно, он также поможет вам:
Да, они оба будут влиять на pH.
В дополнение к приведенному выше комментарию, оба, но метанол особенно обезвоживает образцы - удаление воды определенно повлияет на pH в органеллах. Это будет зависеть от времени. Как продолжительность фиксации, так и время после фиксации перед оценкой клеток будут влиять на рН органелл.
Поскольку вы фиксируете клетки в неводной среде (полагаю, вы используете стандартную фиксацию), вы не используете буфер во время фиксации. Возможно, мы сможем ответить лучше, если вы опубликуете общий протокол, которому следуете.
WYSIWYG
пользователь4739