Почему визуализация антител к убиквитину не работает на моем геле PAGE?

Я использую двумерный гель-электрофорез для визуализации полиубиквитинированных белков. Однако, хотя я могу видеть актин и белок теплового шока, используя соответствующие антитела, я не могу визуализировать их, используя антитело против убиквитина. Может проблема в деградации?

Я провожу изоэлектрофокусировку при 200 В на ночь (минимум 18 часов) и 700 В последние 30 минут. Меня беспокоит, что я подаю больше вольт, чем нужно, потому что стандартный протокол 200 В на 20 минут, 450 В на 15 минут, 750 В на 15 минут, 2000 В на 30 минут, но из-за проблем с блоком питания я не могу этого сделать.

Я уверен, что у меня полиубиквитинирование, потому что я использую препарат, который запускает накопление полиубиквитинированного белка внутри клеток.

Я хотел бы также добавить, что клетки собирают соскобом в холодном PBS, а затем помещают в лед, и осадок также собирают при 4 градусах, чтобы предотвратить деградацию белка.

У вас есть ингибиторы протеазы в буфере для лизиса? Если да, то какие? Кроме того, работает ли ваше антитело против убиквитина при проведении прямого вестерн-блоттинга в SDS-PAGE?
MattDMo, Мое антитело против убиквитина работает при Вестерн-блоттинге.
MattDMo, Мое антитело против убиквитина работает при Вестерн-блоттинге, но я не использую буфер для лизиса. После сбора клеток путем соскабливания с использованием PBS я центрифугирую эппендорф и замораживаю сухой осадок (без PBS) в жидком азоте, затем ресуспендирую. осадок непосредственно в буфере для регидратации (мочевина, CHAPS, амфолиты, бромфеноловый синий, ДТТ), и я добавляю мочевину и вортекс, пока не увижу, что на дне выпадает немного мочевины, затем я центрифугирую его при 10 000 об/мин в течение 5 минут и использую непосредственно надосадочную жидкость. чтобы увлажнить мои полоски.
У вас есть положительный контроль, который вы могли бы использовать рядом с вашими образцами?
Это то, что я ищу, я пытаюсь показать, что можно отличить полиубиквитинирование от отрицательного контроля, но я никогда не делал этого раньше, поэтому мне не с чем сравнивать в качестве положительного контроля, если да, то это было бы означает, что наконец-то процедура работает и пятна появляются.
@Biomedi при адресовании комментария кому-либо, пожалуйста, поставьте символ @ перед его именем пользователя, чтобы они могли быть уведомлены.

Ответы (1)

В лизатах клеток млекопитающих присутствуют стабильные убиквитинированные белки, даже если в клетках существуют активные протеосомы.

Во-первых, вы можете убедиться, что антитело применимо к WB.

Затем вы спросите, работает ли ваша система ВБ, использующая антитела. Вы можете оптимизировать состояние, используя только 1D SDS-PAGE, а затем WB.

Для условия изоэлектрической фокусировки, когда фокусировка завершена, вы получаете очень высокое электрическое сопротивление, поэтому вы можете захотеть контролировать ток после изменения напряжения до 700 В. Ток постепенно уменьшается и стабилизируется на каком-то уровне. Но не знаю можно ли увидеть стабилизацию на 700 В.

Вы также можете проверить, хорошо ли формируются основные белки, такие как актин, при ожидаемом pI. Это может сказать, если принудительное завершение завершено грубо.

Да, антитело применимо к WB, потому что я использовал его раньше. Я использую что-то вроде самодельной схемы, соединяющей мою систему с электродами, которые подключены к резервуару для воды, поэтому я думаю, что ток в порядке. Препарат, который я использую, изменяет протеосому, поэтому белки накапливаются в клетках. Так что, если я поставлю больше времени, чем говорит протокол, это может быть проблема, потому что полиубиквитинированный белок может быть более чувствительным к разрушению или по какой-то причине?
Мочевина обладает сильным денатурирующим действием, поэтому в регидратационном буфере не будет протеазной активности. Я не уверен в активности протеасом во время лиофилизации. Может и хорошо, но без гарантии. Можно ли напрямую добавить регидратационный буфер в клеточный осадок? Или вы можете добавить ацетон или 10% ТХУ для осаждения белков, чтобы протеазы были немедленно денатурированы и инактивированы, а интересующие вас белки могли быть защищены от деградации.
Почему визуализация антител к убиквитину не работает на моем геле PAGE?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v