Я наткнулся на эту мысль, изучая гистологию, что происходит с мечеными флуоресценцией антителами, которые не связываются с антигеном, можем ли мы их увидеть? или антитела, активируемые при связывании антигена, что, в свою очередь, активирует область Fc, к которой присоединена флуоресцентная молекула.
По моему опыту, наиболее распространенный протокол IHC использует первичное антитело, которое связывается с интересующей вас мишенью, за которым следует вторичное антитело (которое несет флуоресцентную метку или меченый фермент) для связывания первичного антитела.
Пример протокола от одного производителя можно найти здесь:
Резюмируя:
Примените первичные антитела, разведенные в буфере для инкубации, в соответствии с инструкциями производителя...
Промойте слайды 3 раза по 15 минут в промывочном буфере.
Инкубируйте со вторичным антителом NorthernLights™, разведенным в буфере для инкубации, в соответствии с инструкциями производителя...
Промойте слайды 3 раза по 15 минут в промывочном буфере.
Стадии «промывки» предназначены для удаления из ткани любых несвязанных первичных антител, а затем любых несвязанных вторичных антител.
Вы все еще можете получить некоторую остаточную фоновую флуоресценцию либо из-за неспецифического связывания вторичного антитела, либо из-за несвязанного первичного антитела, которое не вымывается (я полагаю, что при обычном использовании неспецифическое связывание вторичного антитела будет наиболее важный фактор, влияющий на фон, но я не знаю подходящей цитаты для этого), но вы используете «блокирующие» шаги, чтобы попытаться уменьшить неспецифическое связывание, и предполагается, что все, что осталось, способствует довольно ровному фоновому окрашиванию.
Вы также можете использовать отрицательные контроли, в которых отсутствует первичное антитело, для оценки неспецифического связывания вторичного антитела и проверки любого неожиданного разделения, которое может способствовать возникновению артефактного сигнала.
Доу Пуал