Анализ данных проточной цитометрии [закрыт]

Отказ от ответственности: предполагается, что вы знаете, как работает проточная цитометрия.

Вы провели анализ апоптоза аннексина V на основе потока здесь.

Белок аннексин А5 (аннексин V) связывается с фосфатидилсерином (ФС), который обычно находится в избытке во внутреннем листке живых клеток. Известно, что после инициации апоптоза PS переворачивается на внешний листок. Таким образом, вы можете использовать аннексин V, конъюгированный с флуоресцентной молекулой, такой как флуоресцеинизотиоцианат (FITC), для изучения экстернализированного PS.

7-Аминоактиномицин D или 7-AAD представляет собой флуоресцентный интеркалятор, который можно использовать для обнаружения ДНК и который возбуждается лазером с длиной волны 488 нм (излучается на длиннопроходном фильтре с длиной волны 650 нм и т.п.). Краситель не проникает в живые клетки, поэтому для мертвых или умирающих клеток с нарушенной проницаемостью мембраны он свободно связывается с ДНК.

Проблема с любой из них в отдельности заключается в том, что вы не можете сказать, что клетка 7-AAD+ является апоптотической, и вы не можете сказать, что клетка AnnexinV+ является апоптотической, потому что мы знаем, что у вас есть ранний апоптоз и поздний апоптоз, и в любом случае клетка не полностью мертва, но все же . У вас тоже некроз.

Итак, на точечной диаграмме 7-AAD и аннексина V можно создать 4 квадранта на основе механизма двух компонентов:

Double-negative: No external PS or DNA binding means these are viable cells.
Double-positive: Both external PS and membrane instability means late apoptosis.
AnnexinV single-positive: Undergoing early apoptosis, nucleus isn't yet permeable.
7-AAD single-positive: Completely dead or necrotic, membranes have probably disintegrated.

Суть анализа в том, что вы пытаетесь определить, на какой стадии гибели клеток находятся ваши клетки.

Неокрашенный контроль — это способ взглянуть только на ваши клетки, и он позволяет вам скорректировать автофлуоресценцию , флуоресценцию, генерируемую вашими клетками только из-за возбуждения. Вы также хотите запустить контроли с одним пятном, чтобы увидеть, где лежат ваши положительные и отрицательные популяции. Без элементов управления FMO (флуоресценция минус один, в основном ваша полная панель окрашивания минус цвет) во время стробирования трудно с уверенностью сказать, где очерчены ваши положительные и отрицательные стороны, из-за эффектов перелива и шума.

Примечание о контроле с одним пятном на аннексине V: вы можете видеть, что в необработанном образце аннексин V в основном отсутствует, но в контроле он присутствует в 22,0% клеток. Контроли с одним пятном, в которых вы предполагаете наличие положительных результатов, должны иметь положительные и отрицательные результаты. Без положительных моментов, где вы ставите перед ними ворота? Что, если популяция сместится во время приобретения? Вероятно, они специально использовали умирающие клетки, чтобы создать надежный контроль для этого образца.

Это левая половина ваших данных . Правая половина - процедуры . По сути, вы окрашивали клетки на оба маркера, а затем обрабатывали их Торином-2, Рапамицином и Митомицином, чтобы увидеть, как эти соединения влияют на жизнеспособность клеток. Есть элемент управления, где вы ничего не добавили.

Основываясь на контрольных воротах, вы можете видеть, что образец митомицина имеет наибольший эффект: клетки являются 6,54% положительными по аннексину V, подвергаются раннему апоптозу, а 14,3% являются дважды положительными, подвергаются позднему апоптозу, а 8,09% мертвы. или некротический.

Вы можете сделать вывод, что митомицин, но не другие соединения, оказывает сильное влияние на жизнеспособность клеток.