Каналы проточной цитометрии

Я исправлю этот ответ, когда получу от вас подробности.

Какой у вас цитометр и как настроена оптика? Обычно у вас есть 1-5 лазеров: УФ (355 нм), фиолетовый (405 нм), синий (488 нм), зеленый/желтый (~ 561 нм) и красный (~ 633 нм) лазеры. Ваш номер FL, FL1-4, обычно относится к конкретной комбинации ФЭУ (фотоумножителя) и фильтра. Например, типичный FACSCantoII имеет схему 4-2-2 с 4 ФЭУ на синем лазере, 2 на фиолетовом лазере и 2 на красном лазере (если вы купили устройство таким образом, есть и другие конфигурации). Эти флуоресцентные каналы настроены на обнаружение определенного флуорофора или его эквивалента с помощью полосового фильтра. Базовые фильтры красного лазера FACSCanto II: 660/20 и 780/60. Они фильтруют свет, испускаемый окрашенными клетками в определенном диапазоне длин волн, и вы читаете их как 600 нм +/- 10 нм и 780 нм +/- 30 нм, например.

Вы можете настроить свое программное обеспечение на использование номеров FL или флуорофоров, но вам нужно знать, что такое фильтр FL1 и так далее? Типичные цитометры типа FACSAria: FL1 = FITC, FL2 = PE, FL3 = 7AAD, PerCP/Cy5.5 и т. д., FL4 = APC.

Итак, вы использовали комплект термофишера «живой/мертвый», пожалуйста, предоставьте нам также номера по каталогу .

Мы хотим взять информацию о ваших красителях и о вашем цитометре и согласовать их, чтобы определить, в каком канале они должны флуоресцировать. 488 нм выглядит как FITC или FL1, а 570 нм выглядит как PE или FL2, но они выглядят как лазеры, тогда хотите сообщить мне излучение красителя, чтобы сопоставить его с каналом, используя информацию о конфигурации вашего устройства!

Что касается программного обеспечения, то есть несколько хороших и дорогих вариантов, таких как FCS Express и FlowJo, но они недешевы. Посмотрите, есть ли у вашего ядра или того, что у вас есть, для использования на месте. В противном случае может потребоваться встроенное программное обеспечение цитометра, такое как FACSDiva, что часто и происходит. Я использовал некоторые из «бесплатных», но они очень неуклюжи и/или ужасны в использовании.

R имеет некоторую полезность для многомерного анализа, но вам нужно уметь свободно использовать R, и вы не можете рисовать ручные вентили. Однако существуют полезные пакеты с хорошей документацией, такие как X-cyt (широкий институт). А для визуализации, такой как PCA и t-SNE, в R есть много документации для данных потока. Также учтите, что R загружает все в ОЗУ, поэтому на более медленном компьютере с 2-4 ГБ он может иметь низкую производительность.

Чтобы начать с вашего анализа, я спрошу, почему вы использовали два красителя? Линейка продуктов LIVE/DEAD реагируют со свободными аминами, присутствующими внутри и снаружи клетки. Погибающие клетки имеют более проницаемую мембрану и поглощают больше красителя. Итак, при анализе клеток все положительно, но мертвые и умирающие клетки имеют на 1-2 логарифма более высокую интенсивность окрашивания по сравнению с живой популяцией.

Таким образом, первое, что необходимо для любого эксперимента с потоком, — это элементы управления. У вас есть неокрашенные контроли, контроли FMO и контроли компенсации. Неокрашенный просто дает вам представление о вашей морфологии по рассеянию света, но для экспериментов с низкой размерностью может действовать как FMO. FMO или флуоресценция минус единица — это клетка, окрашенная всеми элементами панели антител/красителей, кроме одного маркера, чтобы вы могли сравнить с полностью окрашенным образцом и посмотреть, где расположить гейт. Элементы управления компенсацией помогают цитометру скорректировать тот факт, что фильтры улавливают излучение других флуорофоров, а не мишени. У вас также есть биологический контроль, что хорошо, потому что для анализа вы всегда хотите видеть, где на ваших точечных диаграммах или гистограммах лежит четкая положительная и отрицательная популяция. Живые клетки помогают вам увидеть, где находятся положительные и отрицательные, но могут иметь слабые положительные сигналы, а неокрашенные клетки будут иметь отрицательную популяцию, которая смещена на 1/2 log или около того, потому что они вообще не содержат красителя. Мертвые окрашенные клетки покажут вам сильный положительный сигнал и, возможно, слабый отрицательный сигнал. Используйте их, чтобы нарисовать свои ворота.

Затем компенсируйте данные в электронном виде с помощью вашего программного обеспечения (следуйте руководству) и создайте точечный график с FSC-A и SSC-A на осях. Только опыт покажет, как выглядят ваши клетки на этом графике, но для справки, образец крови или лейкоцитов хотел бы так:

Вы хотите нарисовать ворота вокруг ваших моноцитов, а затем создать график на основе ваших ворот моноцитов (по крайней мере, отбрасывать мусор). Также полезно для дальнейших экспериментов окрашивать маркером моноцитов, чтобы вы могли сбрасывать все, кроме клеток-мишеней, поэтому используйте, например, CD14, специфичный для моноцитов.

На следующем точечном графике сделайте оси FSC-A и FSC-H. Это этап двойного распознавания, когда лазерное масштабирование области, выполненное перед запуском цитометра, очень помогает (обратитесь к своему основному эксперту). Принцип здесь состоит в том, чтобы удалить (избавиться) клетки, которые слиплись:

Затем вы захотите найти свои целевые клетки. Если они оба являются живыми/мертвыми красителями, у вас будет один и тот же сигнал на двух разных каналах, поэтому вы, вероятно, можете просто выбрать один, например, живой/мертвый зеленый.

Вы можете построить гистограмму FL1 на основе ячеек, сохраненных на графике дублетов. Вы должны увидеть два дискретных пика на логарифмической или биэкспоненциально преобразованной оси интенсивности (хорошо использовать базис ширины -10, но FACSDiva делает это автоматически). Базис ширины является кофактором, который сжимает данные около 0, поэтому отрицательные совокупности становятся меньше, а вы получаете лучшее разрешение среди положительных совокупностей.

Вы нарисуете двойную полосу между положительным и отрицательным пиками или полосу диапазона вокруг положительного и выберите, чтобы программное обеспечение генерировало статистику, чтобы получить ваши проценты. И вы можете повторить для FL2/красного красителя, чтобы получить те же проценты, но оба маркера смотрят на одно и то же.

Затем примените эти ворота ко всем своим образцам и отрегулируйте ворота в зависимости от того, как выглядят данные.

Пожалуйста, попробуйте эту презентацию: https://www.slideshare.net/richardhastings589/kumc-introduction-to-flow-cytometry