Магнитно-активированная сортировка клеток по сравнению с FACS

Магнитно-активированная сортировка клеток (загрузка в формате PDF), или MACS, — это процедура, разработанная Miltenyi Biotec.для отделения клеток от сложных смесей с помощью магнитных наночастиц, покрытых антителами. Антитела специфичны в отношении определенных маркеров клеточной поверхности, либо экспрессируются на представляющей интерес популяции (положительный отбор), либо экспрессируются на нежелательных типах клеток (отрицательный отбор). После добавления шариков, покрытых антителами, к клеточной смеси и инкубации суспензию добавляют в специальную одноразовую разделительную колонку, прикрепленную к магниту, к которой прилипают шарики, а через них проходят немеченые клетки. При выполнении отрицательного отбора интересующей вас популяцией является сквозная популяция, а связанные гранулы и клетки отбрасываются. Если интересующие вас клетки связаны с гранулами (положительный выбор), колонку промывают несколько раз, чтобы убедиться, что несвязанные или слабо связанные клетки промыты.

При сортировке клеток с активацией флуоресценции или FACS исходная сложная смесь клеток сначала метится одним или несколькими антителами, специфичными к маркерам клеточной поверхности, которые были конъюгированы с флуоресцентными красителями. Также можно анализировать клетки, которые экспрессируют один или несколько рекомбинантных флуоресцентных белков в сочетании с интересующим геном, что позволяет проводить отбор клеток без использования антител. После этапов инкубации и промывки эритроциты лизируются, если анализируется цельная кровь. Причина лизиса эритроцитов показана ниже:

Без лизиса эритроциты переполняют цитометр, поскольку они составляют около 95% клеток цельной крови человека. С другой стороны, лейкоциты (лейкоциты) составляют лишь 0,1-0,2% клеток, а лимфоциты составляют от 15 до 50% лейкоцитов.

Затем смесь клеток анализируют на клеточном сортере, таком как BD FACSAria .

^{Откуда: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Fluorescence_Assisted_Cell_Sorting_%28FACS%29_B.jpg}

Клетки проходят гуськом мимо одного или нескольких лазерных лучей, которые возбуждают красители и заставляют их флуоресцировать на определенной длине волны. Затем пользователь может использовать стробирование, чтобы выбрать интересующую его комбинацию и интенсивность цветов, и когда ячейка соответствует критериям, она получает электрический заряд, и электромагниты направляют ее в контейнер для сбора.

Итак, каковы плюсы и минусы каждой технологии? Разделение MACS обычно происходит быстрее, чем окрашивание FACS, и одновременно можно обрабатывать большее количество клеток (иногда на несколько порядков больше, в зависимости от инструмента и протокола). Если вы, например, хотите очистить большое количество CD4+ Т-клеток из цельной крови, MACS может быть лучшим выбором из двух (хотя я предпочитаю RosetteSep).система для этого конкретного требования). MACS не требует довольно дорогого специализированного прибора, хотя при необходимости доступны автоматические платформы. С другой стороны, большинство шариков, отвечающих требованиям MACS, в основном доступны только в Miltenyi, поэтому, если у них нет шариков с интересующим вас конкретным маркером, вам нужно будет выполнить конъюгацию самостоятельно за счет времени и, возможно, драгоценного антитела, в то время как Вы оптимизируете условия. Флуоресцентно-конъюгированные антитела чрезвычайно распространены и доступны практически в бесчисленном количестве компаний, поэтому, если вы не работаете с самогенерируемым антителом, гораздо более вероятно, что вы сможете легко найти его для FACS. Есть _Гранулы MACS, которые содержат антитела, направленные на определенные флуорофоры, поэтому вы можете использовать проточные антитела для MACS, хотя оптимизация, вероятно, по-прежнему необходима. Наконец, разделение MACS возможно только для клеток, на клеточной поверхности которых экспрессируется интересующий вас маркер.

Одним из основных преимуществ FACS является многоцветное окрашивание (в зависимости от используемого прибора). Это значительно упрощает очистку потенциально редких популяций, которые дифференцируются только по их комбинированной экспрессии ряда поверхностных маркеров, что требует нескольких шагов гейтирования. Если бы это было выполнено с помощью MACS, вам нужно было бы пройти несколько циклов очистки, что может занять больше времени, чем FACS, и не обязательно осуществимо, поскольку для каждого запуска MACS требуется определенное количество клеток. С помощью FACS эти редкие популяции (которые могут составлять всего десятки или сотни клеток на миллион) могут быть собраны так же легко, как и более распространенные. Кроме того, как упоминалось выше, для проточного/FACS доступно больше антител, чем для прямого MACS. Кроме того,