Я сортирую производную строку 293. Одна вещь, которая меня беспокоит, это жизнеспособность клеток после сортировки. Обычно я окрашивал и стирал при комнатной температуре (на столе) на нутаторе. Я читал, что большинство процедур сортировки указывают, что вы должны делать это при четырех градусах темноты. Я так понимаю, что это помогает с комкованием, но не за счет ли это жизнеспособности? Вызывает ли холод апоптоз этих клеток?
В настоящее время моя процедура следующая:
Используя HBSS + 1 мМ EDTA + 1% BSA (буфер для сортировки), я суспендирую примерно 10-15 миллионов клеток на мл.
Окрашивание первичным
Вращение при 300 xg в течение 5 минут.
Добавьте 15 мл буфера для сортировки, снова открутите.
Окрашивание вторичным в 1 мл буфера для сортировки
Промыть x2 с 15 мл
Напряжение
Сортировать
Одна вещь, которую я могу сделать, чтобы свести к минимуму гибель клеток, — это окрашивание живых/мертвых клеток (мы только что добавили эту возможность). Другая вещь, которую я читал, заключалась в том, чтобы использовать 50% FBS в пробирке для сбора.
Другая вещь, которая может вызвать беспокойство, заключается в том, что если мы делаем много сортировок, то некоторые пробирки могут долгое время находиться в очереди в буфере сортировки. Как долго это слишком долго?
Наконец, мы используем пуромицин и бластицидин в качестве маркеров селекции для наших библиотек и обычно добавляем их сразу после повторного посева. Должны ли мы подождать некоторое время?
Спасибо за совет
У вас есть несколько вопросов, пожалуйста, постарайтесь ограничить свои сообщения одним вопросом в каждом. При этом я постараюсь решить каждую из ваших проблем.
Вызывает ли холод апоптоз этих клеток?
Нет. Окрашивание при 4°C и отмывка холодным буфером преследуют две цели: сохранить жизнеспособность (все клеточные процессы замедляются при более низкой температуре) и предотвратить интернализацию рецепторов. Этот второй момент особенно важен, поскольку вы используете первичные и конъюгированные вторичные антитела, которые я бы не рекомендовал сортировать без крайней необходимости, например, если используемое вами антитело недоступно в формате прямого конъюгирования.
Одна вещь, которую я могу сделать, чтобы свести к минимуму гибель клеток, — это окрашивание живых/мертвых клеток (мы только что добавили эту возможность).
Живые/мертвые красители, как правило, хорошая идея, но убедитесь, что краситель, который вы используете, не цитотоксичен. L/D всегда должен быть последним этапом окрашивания перед анализом образцов. Лучшим способом (если ваш сортировщик поддерживает его) является использование измерений высоты и площади прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для различения одиночных клеток подходящего размера, а затем сначала гейтирование их, прежде чем гейтирование окрашивания антителами (FITC). или физкультура, или что там у вас вторичное).
Другая вещь, которую я читал, заключалась в том, чтобы использовать 50% FBS в пробирке для сбора.
Я не уверен, насколько это поможет, особенно 293, которые довольно жесткие. Просто убедитесь, что вы достаточно разбавляете собранные клетки в среде, чтобы снизить процентное содержание сыворотки до 10%.
если мы делаем много сортировок, то некоторые пробирки могут долгое время находиться в буфере сортировки в очереди. Как долго это слишком долго?
Пока ваши образцы хранятся в темноте на льду или при 4°C, они должны быть в порядке, по крайней мере, в течение нескольких часов (хотя я бы не стал оставлять их на ночь). Кроме того, убедитесь, что среда для сбора охлаждена, так как она может привести к слишком быстрому изменению температуры клеток с 4° до 37°. Соберите образец, поместите его в чашку, затем поместите при комнатной температуре или в инкубатор (в зависимости от вашего рабочего процесса) и дайте ему нагреться таким образом.
Наконец, мы используем пуромицин и бластицидин в качестве маркеров селекции для наших библиотек и обычно добавляем их сразу после повторного посева. Должны ли мы подождать некоторое время?
Нет, не беспокойтесь об этом. Вы можете подождать, если хотите, или добавить его сразу — я бы предпочел добавить его быстрее, чем нет, чтобы вы не давали нежелательным клеткам шанса вырасти.
WYSIWYG