Я был бы признателен, если бы кто-нибудь прислал мне ссылку на статью или энциклопедию/справочник, содержащие объяснение концепции ферментативной активности. Удивительно, но мне не удалось найти ничего, кроме краткого определения.
Введение в ферменты (pdf) можно найти здесь .
Выдержки из очень популярной публикации Уортингтона, которая первоначально была опубликована в 1972 году как «Руководство по клиническим измерениям ферментов». Хотя часть презентации может показаться несколько устаревшей, основные концепции по-прежнему полезны для исследователей, которые должны использовать ферменты, но не имеют достаточного опыта в энзимологии .
Источник: Уортингтонская биохимическая корпорация.
Количество или концентрацию фермента можно выразить в терминах активности в единицах фермента. См. Википедию :
Активность фермента = количество молей субстрата, преобразованных в единицу времени = скорость × объем реакции. Активность фермента является мерой количества присутствующего активного фермента и, таким образом, зависит от условий, которые следует указать. Единицей СИ является катал, 1 катал = 1 моль с-1, но это слишком большая единица. Более практичным и часто используемым значением является единица фермента (U) = 1 мкмоль мин-1. 1 U соответствует 16,67 нанокаталям.
Вот несколько дополнительных полезных простых видеороликов, объясняющих активность ферментов:
В статье «Ферменты » в Википедии 28 раз встречается слово «активность». Поэтому я могу только предположить, что именно тот факт, что этот термин явно не определен, является проблемой, за которую новичок в этой области не должен извиняться. Я отвечу на него в элементарных — но не самоочевидных — терминах.
Ферменты являются биологическими катализаторами, поэтому катализ является их фундаментальным свойством или качеством. В этом контексте мое определение таково:
Ферментативная активность – это проявление каталитической способности фермента
Я использую слово «проявление» преднамеренно и важно: сущность ферментативной активности заключается в действии или функционировании фермента, потому что именно так мы осознаем его присутствие и, следовательно, как мы делаем количественные или качественные выводы. о его поведении или функции.
Обнаружение активности ферментов
Активность фермента обнаруживается путем наблюдения за реакцией, которую он катализирует, т. е. путем наблюдения — и обычно измерения — превращения некоторого химического реагента (называемого субстратом фермента) в продукт. Это позволяет ответить на некоторые вопросы:
1. Присутствует фермент или нет, и если он присутствует, то способен ли он проявить свой потенциал?
Самый основной вопрос, для ответа на который используется измерение активности фермента, заключается в том, присутствует ли фермент, например, в ткани. На самом деле отсутствие ферментативной активности может иметь и другие интерпретации, помимо отсутствия белка-фермента: фермент может присутствовать, но денатурированный или отравленный, или он может присутствовать в неактивной форме из-за отсутствия какого-либо вторичного агента (кофактора, регуляторного фактора). молекула), необходимая для его функционирования.
2. Сколько там фермента?
В экспериментальной работе, когда хотят сравнить количество фермента в разных тканях, проконтролировать его очистку от других белков или изучить влияние агентов и условий на его функционирование, нужно не просто обнаружить его (например, наблюдая, как окрашенное вещество образуется), но для измерения количества фермента или функционирующего фермента. Для количественной оценки ферментативной активности мы измеряем количество субстрата, превращенного в продукт в заданное время в подходящих условиях.
Объяснение используемых единиц и подходящих условий доступно в стандартных текстах и в Интернете. Мой собственный самоучитель по этой теме можно найти здесь .
3. Какова природа катализируемой реакции или в ней участвует более одного фермента?
Это другие вопросы, на которые может ответить измерение активности фермента или нечистого препарата. Здесь важно то, какая именно реакция катализируется. Если фермент может катализировать фосфорилирование D-глюкозы до глюкозо-6-фосфата, может ли он также катализировать фосфорилирование L-глюкозы, т. е. специфичен ли он для одного ротамера? Если препарат может также фосфорилировать фруктозу (например), действительно ли в препарате присутствуют два разных фермента? Если он фосфорилирует какой-то другой сахар в 50 раз лучше, чем глюкоза, возможно, его функция внутри клетки отличается от той, что предполагалась ранее.
Деятельность как общее понятие в науке и биологии
Измерение активности, а не количества не ограничивается ферментами. Также интересует активность гормонов , лекарств , нейротрансмиттеров и т. д . (например, чтобы определить, на какие ткани они воздействуют и каковы их эффекты). И в более общем смысле в науке мы выводим существование вещей по их способности что-то делать — пример из физики — гравитация.
Ферментативная активность относится к динамическому процессу фермента, катализирующего реакцию, и является мерой количества каталитически компетентного фермента, присутствующего в препарате.
Мы измеряем активность фермента, проводя пробную ферментативную реакцию, то есть анализируем фермент. Испытание или анализ проводят в первую очередь в условиях, когда работает фермент. Например, решающее значение может иметь рН, а также наличие или отсутствие ингибиторов или активаторов. Кроме того, анализ проводят в условиях, когда экспериментатор может прямо или косвенно обнаружить каталитическую трансформацию, возможно, путем наблюдения за производством продукта или потреблением субстрата.
Например, если я хочу измерить активность дегидрогеназы, я мог бы измерить уменьшение поглощения при 340 нм, где сильно поглощается НАДН, но не НАД(+). В спектрофотометре это может выполняться непрерывно во времени и является примером непрерывного анализа.
Тем не менее, может не быть удобного изменения поглощения, но у нас может быть радиоактивный субстрат. В этом случае мы могли бы провести наше испытание в условиях, в которых мы ожидаем, что фермент будет работать, скажем, 30 минут, остановить реакцию (например, путем денатурации фермента кислотой) и выделить радиоактивный продукт . Это может быть примером прерывистого анализа.
В обоих случаях мы наблюдаем изменение за счет фермента, катализирующего определенную реакцию, то есть измеряем активность фермента.
Теперь мы подошли к важному различию. Ферментный анализ представляет собой меру каталитической активности, которая может быть связана или не связана с общим количеством присутствующего ферментного белка. Рассмотрим генетическое заболевание, которое приводит к полному отсутствию активности определенного фермента в органе. Например, мы анализируем образец печени на лактатдегидрогеназу и не обнаруживаем ее (возьмем тривиальный пример). Это может означать, что фермент не вырабатывается: фермента там нет. Но это также может означать, что фермент присутствует, но вырабатывается в неактивном состоянии. Возможно, «нормальный» фермент имеет незаменимый тирозин в активном центре, но генетическая мутация изменила его на фенилаланин в рассматриваемом случае.
Если у нас есть антитело, направленное против исследуемого фермента, мы могли бы разработать иммуноферментный анализ (ИФА), который будет (если он хорош) специально измерять общее количество присутствующего белка , независимо от того, активен он или нет , даже в неочищенной печени. извлекать. (Конечно, Вестерн-блот также может обнаружить присутствие неактивного белка). То есть ферментный анализ дает оценку количества присутствующего фермента на основе ферментативной активности , тогда как ИФА дает оценку общего количества присутствующего ферментного белка.
Активность фермента обычно выражается в виде количества субстрата или продукта, трансформируемого за минуту или секунду: например, в микромолях/мин. Также обычно измеряют общее количество присутствующего белка и сообщают об активности фермента в микромолях/мин на миллиграмм (общего) белка. Это конкретная деятельность и позволяет легко сравнивать. Почти всегда часть «на миллиграмм» измерения удельной активности относится к общему количеству присутствующего белка (измеренному с помощью анализа белка Лоури или подобного).
(Если, например, лаборатория А сообщает, что 20 мкл их экстракта печени имеют активность а-дегидрогеназы 5 мкмоль/мин, а лаборатория Б сообщает, что 20 мкл их экстракта печени имеют активность а-дегидрогеназы 50 мкмоль/мин, эти измерения вполне могут быть идентичными при сравнении на основе белка (микромоль/мин на мг), и единственная разница заключается в том, что печень А была экстрагирована в 100 объемах буфера, а печень В была экстрагирована в 10 объемах буфера).
Единицы активности фермента неизменно относятся к конкретным условиям анализа, и это может быть очень важным фактором при планировании эксперимента. Кроме того, ферменты лабильны и со временем их активность может снижаться (например, при длительном хранении). Если, например, протокол требует, чтобы вы добавили 10 мг ферментного препарата с удельной активностью 100 ЕД/мг (100 мкмоль/мин на мг), но замораживание ферментного препарата привело к денатурации, вы добавляете 10 мг ферментного препарата. ферментный белок, но без ферментативной активности . Это также может быть важно.
Наконец, отличная ссылка:
Принципы ферментативного анализа и кинетических исследований К. Ф. Типтона в Enzyme Assays: A практический подход
Роланд
Дэйвид