Я планирую увеличить масштаб реакции ПЦР, и мне интересно, не будет ли проблемой заполнение пробирок для ПЦР до максимального объема 200 мкл. Это означало бы гораздо меньше пипетирования, так как мне понадобится только 1/4 пробирок.
Типичные протоколы, которые я видел, всегда используют 50 мкл для реакции ПЦР. Мне интересно, есть ли какие-либо проблемы с большими объемами, например, различия в теплопередаче, которые могут вызвать проблемы, если я увеличу объем в одной пробирке.
Является ли масштабирование объема проблематичным? Какие-то конкретные аспекты, которые я должен учитывать?
(Также слишком длинный для комментария.) Этот вопрос напомнил мне анекдот, рассказанный Артуром Корнбергом, относительно подхода к масштабированию, который был принят Рейджи Окадзаки (первооткрывателем фрагментов Окадзаки ).
Вот цитата из книги Артура Корнберга «Ради любви к ферментам: одиссея биохимика».
Исследовательский стиль Рейджи нелегко понять из его публикаций, но он жив в моей памяти. Один пример я называю приемом Окадзаки. При очистке энима он использовал стадию нагревания: 10 мл раствора фермента выдерживали в пробирке при 70°С в течение пяти минут; затем коагулированные примеси удаляли центрифугированием. Когда он дошел до масштабирования процедуры до нескольких литров, он просто повторил первоначальную процедуру нагревания несколько сотен раз. Мне было неловко сообщать о такой несложной процедуре в нашей публикации. Но потом я понял, что он смог выполнить этот шаг за несколько часов и не видел смысла тратить драгоценное время и материал на обучение нагреванию в большом стакане или колбе. Потом, когда другой мой студент очищал фермент с помощью стадии нагревания и должен был увеличить свою процедуру в 2000 раз с 3 миллилитров до 6 литров, я посоветовал маневр Окадзаки: он добавил по 3 миллилитра в каждую из 200 пробирок для нагревания. и этап центрифугирования, повторяя процедуру девять раз. Другой студент, который попытался нагреть большой объем этого фермента за один прием, потерял его в виде толстого сгустка.
Слишком длинно для комментария: я бы сказал, что это зависит от PCR. Я лично использовал максимальные объемы 50 мкл, если мне нужно было приготовить большие объемы, я делал одну смесь, которая впоследствии распределялась по большему количеству тюбиков с максимальным объемом 50 мкл.
Проблема с большими объемами состоит в том, чтобы получить быстрый и равномерный нагрев и охлаждение. Если снаружи трубы быстрее, реакция начинается уже там, в то время как в середине этого может не быть. Это может привести к неравномерной денатурации и усилению вашего шаблона. Последнее особенно проблематично, когда вы усиливаете короткие последовательности. Там время амплификации может уже закончиться, и программа ПЦР будет продолжаться до того, как шаблон будет готов, что приведет к уменьшению вашего полноразмерного продукта и обогащению более коротких версий.
Есть еще одна проблема, которая может возникнуть в больших реакциях: из-за градиентов реакционной способности из-за градиентов температуры я думаю, что возможно, что реагенты (dNTP, ионы Mg) могут образовывать градиенты, которые еще больше снижают хороший выход.
Наконец, я проверил кое-что на одной из наших машин для ПЦР: пробирка для ПЦР вставлена в блок нагрева/охлаждения. Он не полностью вставлен в блок, а частично выпирает, так что если наполнить его до максимальной емкости, то верхние 75-100 мкл (примерно) окажутся за пределами нагревательного блока и у нас тепловая проблема. Реакционная смесь там будет только нагреваться за счет конвекции.