После получения рекомбинантной ДНК обычно трансформируют E. coli для скрининга рекомбинантной ДНК и ее амплификации. Но я хотел бы спросить, можем ли мы амплифицировать его с помощью ПЦР?
Я думаю, что после рестрикции будет 3 молекулы ДНК:
Чтобы амплифицировать только рекомбинантную плазмиду, можем ли мы разработать праймеры, которые охватывают фрагмент вставки и вектор, который может хорошо сочетаться только с рекомбинантной плазмидой, но с другими типами?
Однако я не знаю, повлияет ли это ограничение в дизайне праймера на GC%. Поэтому я думаю, можем ли мы провести обработку фосфатазой, чтобы предотвратить самолигирование, а затем добавить экзонуклеазу для переваривания всей линейной ДНК, т.е. сохранить только рекомбинантную плазмиду, чтобы в конечном итоге можно было преодолеть ограничение (поскольку мы можем создать праймер в подходящем месте на рекомбинантной плазмиде сейчас). ), могу я спросить, это действительно?
После ПЦР рекомбинантная плазмида линеаризуется (2 тупых конца, созданных прямым и обратным праймерами, если я правильно понимаю?), которая становится менее стабильной, так как может быть расщеплена экзонуклеазой. Следовательно, можем ли мы добавить лигазу для циркуляризации плазмиды? Могут ли лигазы лигировать 2 тупых конца?
Я не знаю, можно ли использовать этот метод, но я думаю, что если мы просто хотим амплифицировать ДНК (не нужен белковый продукт) после создания рекомбинантных плазмид, не будет ли это более эффективным, чем бактериальная трансформация?
Спасибо и исправьте, если я допустил ошибки.
Я вовсе не уверен, что вы узнаете этот процесс здесь. Как правило, бактерии используются для амплификации плазмиды до уровней, на которых ее можно было бы использовать. Выполнение этого с помощью ПЦР технически возможно, но намного дороже, имеет более высокий уровень ошибок (из-за склонных к ошибкам ДНК-полимераз) и требует дополнительных шагов. Вы также не получите столько ДНК, сколько из бактериальной культуры. Культура также масштабируема — вам нужно больше ДНК, просто выращивайте больше бактерий. Как только вы трансформируете плазмиду в бактериальный штамм, вы можете хранить ее запасы при температуре -80 в глицериновой форме. Затем вы можете соскоблить небольшой кусочек, вырастить его за ночь и выполнить процедуру менее 2 часов на следующий день и в итоге получить несколько микрограммов очень чистой ДНК.
Я настоятельно рекомендую вам прочитать хороший протокол клонирования, например, найденный в Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory manual или Current protocols . Клонирование существует уже более 50 лет, я думаю, что этот процесс более или менее оптимизирован.
Обычный процесс создания плазмиды выглядит следующим образом:
Бактерии, как правило, переваривают линейную ДНК за счет производства экзогенных ДНКаз, а линейная ДНК часто плохо трансформируется, поэтому экзонуклеазный этап не нужен.
Обычно при скрининге колоний вы используете праймеры, специфичные для вставки, или, если вы хотите определить, была ли вставка вставлена в определенной ориентации, то один праймер на основу, а другой на вставку. Только амплификация обоих праймеров, дающая полосу правильного размера, является положительной вставкой. В этом случае можно получить праймеры, которые распознают только те плазмиды, которые имеют вставку.
Есть несколько случаев, когда вы можете создать праймеры, охватывающие всю вставку — например, секвенирование всей вставки. Плазмиды часто уже содержат такие сайты. Если вы видите что-то с пометкой M13 или BGH, это обычные сайты для секвенирования праймеров. Другое распространенное использование: если вам нужен ряд вставок (например, подготовка библиотеки), и вы не знаете, насколько большими могут быть вставки, вы можете использовать праймеры, охватывающие вставку, для идентификации плазмид, которые самолигируются (без вставки). так как они будут производить только очень маленькие продукты на геле. Невозможно сделать праймеры, охватывающие вставку, которые распознают только рекомбинанты . Нет необходимости в лигировании или экзонуклеазах.
Другой возможный сценарий — это когда вы хотите изменить базу (или более 1) в уже построенной плазмиде. Это называется сайт-направленным мутагенезом . В этом случае вы хотите, чтобы ПЦР прошла весь путь вокруг плазмиды, а родительская ДНК (из плазмиды) была повреждена путем расщепления специфичным для метилирования рестрикционным ферментом DpnI (продукты ПЦР не метилированы, но обычно метилированы, выращенные бактериями), и круговой продукт с надрезами, восстановленный бактериями после трансформации.
Праймеры не повлияют на содержание GC в вашем продукте. Если вам не нравится содержание GC ваших праймеров, переместите их в более подходящее место.
Раньше все обрабатывали переваренную ДНК щелочной фосфатазой (ЩФ), чтобы предотвратить самолигирование. На практике от АР очень трудно избавиться или инактивировать, и они, как правило, удаляют необходимый фосфат из вкладыша, когда вы смешиваете продукты вместе при лигировании. Это приводит к торможению лигирования и снижает ваши шансы на успех.
МайкиС
многослойный