Ищет ли ДНК-лигаза комплементарность в липких концах?

Может ли ДНК-лигаза запечатать два некомплементарных липких конца, если реакцию инкубируют в оптимальных условиях? Я делаю почти 100% двойное переваривание в лаборатории. Однако во время лигирования, когда я выполняю контроль без вставки, я все равно получаю много циркуляризованных векторов, и они вызывают массовые ложные срабатывания во время преобразования. Может ли лигаза, запечатывающая два некомплементарных липких конца, быть возможной причиной этого?

Поскольку ДНК-лигаза может лигировать ДНК с тупым разрезом, она, вероятно, может лигировать неправильные липкие концы, но вероятность этого мала. Вы проводите реакцию с антарктической фосфатазой, чтобы удалить 5'-фосфат из вашего вектора? Это уменьшит вероятность плохих перевязок.
К сожалению, я этого не делаю, потому что некоторые люди могут сделать клонирование без обработки фосфатазой в нашей лаборатории, и я в основном следую их процедурам. По крайней мере, пока.
Я бы определенно попробовал контроль фосфатазы и посмотрел, не в этом ли проблема.
Вы также можете получать ложные срабатывания из-за неполного пищеварения. Вы проверили переваренную плазмиду на геле? Также используйте очень небольшое количество плазмиды (≤500 нг) при лигировании.
Я бы также заподозрил неполный дайджест. В зависимости от вашего метода трансформации, достаточно нескольких сотен непереваренных плазмид, чтобы получить ложноположительные результаты, и вы не увидите их в контрольном геле. Вы можете попытаться извлечь из геля только интересующую полосу.
Я использую около 300 нг плазмиды для трансформации. Некоторые говорят, используйте меньше, но, к сожалению, у них нет логического объяснения. Насчет неполного пищеварения: я тоже об этом думал. Однако, поскольку сайты двух ферментов очень близки (всего 31 п.н. между сайтами, тогда как размер вектора составляет около 6 т.п.н.), когда я извлекаю полосу разреза из геля, я также извлекаю отдельные перевары, и, похоже, нет никакого способа убедиться в этом. если я извлекаю только двойные дайджесты или нет. Я могу попробовать лечение фосфатазой, но есть ли у вас какие-либо идеи по поводу вопроса о лигазе?
Они обнаружили , что лигаза Т4 может эффективно лигировать несовпадающие концы, что приводит к образованию до 5 несовпадающих оснований. Какую лигазу вы используете?

Ответы (1)

Если я правильно понимаю, вы готовите свой клонирующий вектор, переваривая его двумя ферментами, которые находятся на расстоянии 31 п.н. друг от друга. Если у вас есть высокий фон рециркуляризованного вектора, посмотрите, есть ли уникальный сайт фермента рестрикции в пределах этих 31 п.н. Если есть, и если фрагмент, который вы пытаетесь вставить, также не имеет этого сайта, тогда простым подходом будет инактивация лигазы и переваривание реакции с помощью третьего фермента. Это должно резко снизить фон рециркуляризованного вектора. Если после гель-очистки скелета вектора после двойного переваривания вы получаете значительный фон рециркуляции, то вы можете легко проверить свою гипотезу о лигазном лигировании несовпадающих липких концов: должны исчезнуть как стартовые сайты, так и любые сайты между ними. должен исчезнуть. Вы проверяли это?

Я решил проблему, увеличив время переваривания и приготовив новые тарелки. Теперь я получаю только несколько колоний, когда нет вставки - возможно, есть еще какие-то одиночные дайджесты, и лигаза восстанавливает разрыв - и это больше не является серьезной проблемой. Я читал о вашем предложении в другом месте, но между моими сайтами был только один такой сайт, и фермент для него был редким и дорогим, поэтому я использовал другой подход, как я уже упоминал. Очевидно, я получил ложные срабатывания, потому что мои ферменты были неаккуратны, а мои пластины были немного старыми.
Ищет ли ДНК-лигаза комплементарность в липких концах?
СпросиСетьПолитика конфиденциальности1y, 0v