Как я могу улучшить выход гель-экстракции? Мы используем стандартный протокол Qiagen, гель-экстракцию, растворяем в буфере QG при 42°C и очищаем с помощью анионообменных колонок. Однако с 500 нг мы в конечном итоге получаем 100 нг с выходом 20%. Мне было любопытно, что еще было опробовано для извлечения геля.
Мы также добавляем IPA и NaOAc в растворенную смесь перед очисткой колонки.
Когда я оптимизировал экстракцию геля своими руками, два фактора оказались решающими для максимизации выхода геля:
рН элюирующего раствора. Раньше я элюировал конечный продукт водой, обработанной DEPC, но выход сильно варьировался по мере изменения pH воды. Лучше использовать буфер EB, так как он поддерживает стабильный pH 8.
Самое главное, * инкубируйте элюирующий раствор с колонкой как можно дольше (а также дважды элюируйте). * Я инкубирую около 10 минут, что дольше, чем они рекомендуют, но работает намного лучше.
Попробуйте растворить при 50С. В наборе для извлечения геля Qiagen указано, что он растворяется при 50°C или до полного растворения.
Размер геля тоже важен. Убедитесь, что он составляет 1,5% или меньше, а размер геля должен быть меньше 400 мг.
Также обратите внимание на первый шаг. Если цвет жидкости отличается от цвета первого буфера QG, значит, проблема с pH.
Элюируют из колонки элюирующим буфером, предварительно нагретым до 50-60°. Я помещаю свой в инкубатор на время экстракции, чтобы он был теплым, когда я приступаю к элюированию. Кажется, это помогает уступить.
дрозофила